蘇學思，張玉寶，王亞軍，郭志鴻，邱 陽，唐國亮

(1.中國科學院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院，蘭州 730000；2.中國科學院大學，北京 100049；3.甘肅省生態(tài)與農業(yè)綜合試驗野外科學觀測研究站，蘭州 730000)

南芥菜花葉病毒(Arabismosaicvirus，ArMV)屬于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)豇豆花葉病毒亞科(Comoviridae)線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)成員，是危害花卉、果樹、蔬菜等經濟作物的主要病原，是列入中國進境檢疫名錄的二類植物病毒[1]。ArMV病毒顆粒呈正二十面體結構，基因組由兩條正義單鏈RNA組成，編碼兩個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)[2]。ORF1由2 284個氨基酸多肽組成，編碼一個多聚蛋白，經蛋白酶剪切后共形成6個成熟的蛋白，分別為X1，X2，NTB，VPg，Pro，Pol[3]。ORF2包含有1 083個氨基酸多肽，也編碼一個多聚蛋白，剪切后形成病毒的歸巢蛋白(Homing protein，HP)、運動蛋白(Movement protein，MP)和衣殼蛋白(Coat protein，CP)[4]。

ArMV寄主廣泛，可以侵染約174屬215種植物，其中如煙草、草莓、葡萄、大豆、番茄等皆為中國廣泛種植的重要經濟作物[5]。ArMV所引起的病毒病癥狀主要表現為葉片花葉、斑駁、黃化，嚴重則表現為矮化、畸形、壞死等，顯著降低作物的產量和品質[6]。百合(Lilium)是一種集觀賞、食用和藥用價值于一體的重要經濟作物，近年來被發(fā)現是ArMV的新寄主[7-8]。百合感染ArMV后，除葉片和植株表現出上述癥狀外，種球部位還會出現壞死斑[9]。即便寄主相同，癥狀也會隨著株系、栽培品種、季節(jié)以及年份不同而發(fā)生變化。

為了有效控制ArMV的危害，并且制定出準確、高效的防治策略，迫切需要開發(fā)出快速高效的病毒檢測技術。血清學方法因為特異性強、靈敏度高、檢測速度快、大樣本檢測等優(yōu)點，被作為田間最常用的病毒檢測方法[10]。然而提取病毒粒子為抗原的傳統(tǒng)方法，制備抗體存在著特異性差、效價低的問題[11]。近年來，運用分子生物學的方法，構建基因原核表達載體，誘導表達病毒蛋白，以此為抗原制備抗體的技術已經發(fā)展成熟，獲得的抗體具備很高的特異性和效價，被廣泛應用于植物病毒的抗體制備。

病毒基因組分析表明，ArMV無包膜蛋白(Envelope protein，ep)，其CP蛋白在維持病毒生存及病毒侵染寄主的過程中發(fā)揮著關鍵性作用[2]。目前，國內關于ArMV CP蛋白原核表達的研究，均是以部分CP基因為對象，在分析CP蛋白的結構和功能時存在不足[12-13]。因此，選擇克隆ArMV CP基因全長，誘導表達出具備完整結構和功能的CP蛋白，將為研究ArMV的致病機理奠定基礎。

本研究從感染ArMV的百合中克隆ArMV CP基因全長，構建ArMV CP基因的原核表達載體，轉化E.coliBL21(DE3)，經IPTG誘導表達，獲得大量高純度的ArMV CP蛋白，并以此為抗原制備高特異性的多克隆抗體，以期為ArMV的血清學檢測技術開發(fā)和致病機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

帶毒東方百合雜交品種‘木門’(‘Conca D’or’)葉片采自中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院皋蘭生態(tài)與農業(yè)綜合試驗站(36°13″N，103°47″E)，經RT-PCR檢測[8,14]，獲得分別感染百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、百合斑駁病毒(Lilymottlevirus，LMoV)、車前草花葉病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus，PlAMV)和ArMV的百合樣品，-70 ℃保存。

植物總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit)購自天根生化科技(北京)有限公司；植物蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；質粒微量抽提試劑盒(E.Z.N.A.○RPlasmid DNA Mini Kit Ⅰ)購自Omega公司；逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)、DNA回收試劑盒(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit)和克隆載體pMDTM19-T購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-NTA預裝重力柱(Ni-NTA Pre-Packed Gravity Column)和NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑盒(藍色)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株以及表達載體pET-28a(+)由甘肅省寒區(qū)旱區(qū)逆境生理與生態(tài)重點實驗室保存。

1.2 引物設計與合成

根據已經公布的百合ArMV CP基因序列(GenBank登錄號：KJ481187)設計合成特異性引物。為便于表達克隆化基因，分別在正向和反向引物上添加BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點，引物序列如下(下劃線表示引入的酶切位點)：

正向引物：5′-GGATCCGGTCTTGCTGGTAGAGGTTCTG-3′

反向引物：5′-CTCGAGAACTTTAAAGCATGTTCTTCCGTA-3′

以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 ArMV CP基因的PCR擴增

使用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，以提取的總RNA為模板，按照試劑盒說明逆轉錄合成cDNAs，然后 PCR擴增ArMV CP基因。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，循環(huán)擴增30次；72 ℃延伸7 min。擴增完畢，PCR產物經 15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段通過DNA回收試劑盒純化。

1.4 重組克隆載體的構建

純化片段連接T載體，轉化E.coliDH5α。用質粒微量抽提試劑盒提取質粒，PCR篩選陽性克隆。陽性質粒經BamH Ⅰ和XhoⅠ切割， 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，將酶切及凝膠電泳鑒定為陽性的質粒送交北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序，證實序列正確后命名為pMD19-T-ArMV。將測序獲得的CP序列提交GenBank，借助BLAST、ClustalW和DNAStar軟件進行序列比對、分析以及ArMV CP蛋白的抗原表位 預測。

1.5 重組原核表達載體的構建

pMD19-T-ArMV質粒和pET-28a(+)質粒經BamH Ⅰ和XhoⅠ切割，回收目的片段， 16 ℃連接過夜。連接產物轉化E.coliDH5α，涂布平板。挑取單克隆過夜培養(yǎng)，PCR篩選陽性克隆。提取質粒，經BamH Ⅰ和XhoⅠ切割，鑒定正確后命名為pET-28a-ArMV。未經酶切處理的重組質粒作為陰性對照。

1.6 ArMV CP蛋白的原核表達

陽性質粒pET-28a-ArMV轉化E.coliBL21(DE3)，接種至含有50 μg/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日按1∶100接種于相同培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD600達到0.7時添加1.0 mmol/L IPTG誘導，37 ℃振蕩培養(yǎng)，分別于3、4、5、6、7 h收集菌體進行SDS-PAGE電泳。未插入目的片段的空質粒誘導蛋白和未經IPTG誘導的重組菌蛋白作為陰性對照。

按相同的培養(yǎng)條件，誘導培養(yǎng)1 L菌體。菌體經0.01 mol/L PBS溶液懸浮、超聲破碎、離心后，取上清。按照Ni-NTA重力柱操作指南純化目的蛋白。

1.7 ArMV CP多克隆抗體的制備

用1 mg/mL 的ArMV CP純化蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔。初次免疫中，將1 mg純化蛋白和完全弗氏佐劑等量混合均勻，進行皮下多點注射。兩周后進行增強免疫，將等體積的抗原和不完全弗氏佐劑充分混勻，進行皮下多點注射。每間隔兩周進行1次增強免疫，第4次增強免疫1周后頸動脈采血，分離得到抗血清。收集到的血清借助飽和硫酸銨沉淀法和DE52陰離子交換柱層析法進行純化，從而獲得兔抗ArMV多克隆抗體IgG。

1.8 ArMV CP多克隆抗體的鑒定

稱取0.1～0.2 g分別感染LSV、CMV、LMoV、PlAMV及ArMV的百合葉片組織，加入液氮研磨，按照植物蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后， 15 V恒壓轉移至PVDF膜，轉膜后移入1%酪蛋白封閉液中，4 ℃過夜封閉。以制備的ArMV CP多克隆抗體作為一抗(1∶10 000)，AP標記的羊抗兔IgG作為二抗(1∶20 000)，通過NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑盒(藍色)顯色。

2 結果與分析

2.1 ArMV CP基因的克隆

以侵染東方百合雜交品種‘木門’(‘Conca D’or’)的ArMV的基因組RNA為模板，PCR擴增ArMV CP基因。電泳檢測結果顯示，得到的擴增片段大小為1.0～2.0 kb，符合預期(1 515 bp)(圖1)。將擴增的ArMV CP序列克隆于pMD-19T載體，測序結果顯示ArMV CP序列的長度為1 515 bp，編碼505個氨基酸組成的CP蛋白，推測蛋白質相對分子質量為56 ku。NCBI上提交克隆所得序列，獲得的登錄號為MT323117。

2.2 ArMV CP基因的序列分析

將克隆的百合ArMV CP基因與GenBank中不同分離物的ArMV CP基因核苷酸及氨基酸序列進行比較。BLAST結果表明，百合ArMV CP基因的核苷酸和氨基酸序列均與采自波蘭的R14_3分離物(MH316599)的相似性最高，分別為93.6%和98.2%；與其他分離物的核苷酸序列相似性為81.6%～93.5%，氨基酸序列相似性為92.2%～97.6%；與已注冊的7個百合分離物(AB279741、KJ481182、KJ481183、KJ481184、KJ481185、KJ481186和KJ481187)相比，核苷酸序列相似性為89.4%～90.2%，氨基酸序列相似性達到95.5%～96.4%。

借助DNAStar軟件分析百合ArMV CP蛋白的二級結構、親水性和柔韌性，并預測其抗原表位(圖2)；將71個不同分離物的ArMV CP蛋白氨基酸序列進行ClustalW比對，獲得ArMV CP中相似性達到90%的保守位點。在抗原性指數較高(指數≥0)的區(qū)域，選取親水性好(指數≥0)且具有β轉角或無規(guī)則卷曲結構的區(qū)域作為潛在的抗原表位(氨基酸數≥4)，對比抗原表位和保守位點的氨基酸組成，發(fā)現抗原表位所包含的61個氨基酸中保守位點占據85.2%，表明ArMV CP蛋白的抗原表位保守。

2.3 重組原核表達載體的構建

pET-28a重組質粒經PCR擴增得到約1.5 kb的條帶，長度與ArMV CP基因全長保持一致(1 515 bp)。用BamH Ⅰ和XhoⅠ切割pET-28a重組質粒，電泳檢測結果顯示，重組質粒被切割成兩條帶，分別與PCR產物(1.5 kb)和pET-28a質粒(5 kb)的大小一致(圖3)。

2.4 ArMV CP蛋白的原核表達

陽性質粒pET-28a-ArMV轉化E.coliBL21(DE3)菌株，經1.0 mmol/L IPTG誘導，SDS-PAGE分析，觀察到目的蛋白有明顯表達(圖4)。但隨著誘導時間從3 h增加到7 h，目的蛋白表達量沒有顯著變化。

2.5 Western blot免疫印跡

提取百合葉片總蛋白，經Western blot檢測，發(fā)現抗體與感染ArMV的樣品在預期大小的位置處發(fā)生特異性反應，而與健康百合樣品以及分別感染LSV、CMV、LMoV、PlAMV的樣品無交叉反應，表明抗體能夠特異性結合ArMV CP蛋白，具有很好的特異性(圖5)。

3 討 論

貿易全球化推動了中國經濟的發(fā)展，但是也為國內生物安全帶來挑戰(zhàn)，近些年來，海關不斷從進境的百合、水仙、郁金香等花卉植物上檢測到ArMV[15-16]。目前，該病毒的防治主要依賴于快速靈敏的血清學檢測技術，相較于核酸檢測技術，前者的優(yōu)點在于避免病毒RNA提取的困難，操作簡便，并且適用于大規(guī)模的田間檢測。病毒CP蛋白在原核表達中具有較好的免疫原性，因此通常被作為抗體制備的抗原，同時借助原核表達也避開直接純化病毒所面臨的難題[17-18]。然而，國內學者選取部分ArMV CP基因進行原核表達，沒有注意到CP結構和功能的完整性。于翠等[15]使用商業(yè)化的多克隆抗體建立DAS-ELISA技術體系，從水仙種球上檢測到ArMV。一方面，商業(yè)化抗體相較于本研究所制備的抗體，對于檢測百合上ArMV的特異性可能有所降低；另一方面，ELISA檢測的結果存在非特異性的可能，無法應用于病毒蛋白表達分析，不能滿足ArMV致病機理研究的需要。本研究在此基礎上，克隆CP全長基因，表達具備完整結構與功能的CP融合蛋白。序列分析結果表明ArMV不同分離物的CP序列相似性高，抗原表位保守，因此以純化ArMV CP蛋白為抗原制備多克隆抗體，可用于檢測感染不同宿主的ArMV。此外，本研究制備的抗體效價高，建立的Western blot方法能夠用于分析病毒蛋白的表達量，可用于病毒蛋白功能的分析及致病機理的研究。

為了提高目的蛋白表達量，獲得優(yōu)異的抗體，對重組蛋白誘導表達條件進行初步摸索。本研究設置蛋白誘導表達的時間梯度，探究誘導時間和蛋白表達量的關系。SDS-PAGE結果表明，增加誘導時間，ArMV CP蛋白表達量沒有發(fā)生明顯變化(圖4)。這個結論與王玉等[19]的研究并不一致，可能與兩者所用誘導劑的濃度差異有關。本研究用于誘導蛋白表達的IPTG為1.0 mmol/L，相比0.2 mmol/L濃度明顯偏高，這可能會抑制菌體的生長[20]，從而使目的蛋白的表達量在3 h達到峰值。

然而在優(yōu)化誘導時間后，發(fā)現本研究獲得的ArMV CP蛋白表達量并不高，推測其原因可能與表達載體及密碼子偏性有關。谷紅等[21]構建不同的原核表達載體，發(fā)現PRRSV dORF5(去掉N端疏水序列)在pGEX-4T-2表達載體中能夠大量表達，而在pET-28a和pET-5a中不表達。即表達載體影響蛋白的高效表達，CP蛋白表達量低可能受到載體的影響。盧海強等[22]根據畢赤酵母的密碼子偏好性，優(yōu)化嗜熱甘露聚糖酶ManBK的基因序列，并以此構建pPIC9K表達載體，得到高濃度的嗜熱甘露聚糖酶。密碼子偏性是普遍存在的現象，ArMV和大腸桿菌的密碼子偏性不同，這可能是制約CP蛋白表達的原因。

蛋白純化和抗體特異性檢驗也可以進行優(yōu)化，從而提高抗體制備的效率。Ni-NTA柱親和層析純化時，最初獲得的純化蛋白濃度較低，后來在蛋白上樣之后增加孵育過程，即在4 ℃下孵育4～10 h，使目的蛋白與柱子的結合更加充分，顯著提高純化蛋白含量。Western blot鑒定抗體特異性的過程中封閉是非常重要的環(huán)節(jié)之一，只有背景干凈的顯色結果才具有說服力。尤其是對于化學顯色檢測系統(tǒng)，因檢測靈敏度極高，對背景信號的要求非常嚴格。本研究最初選擇脫脂奶粉和BSA作為封閉劑，但是顯色結果中均出現較高的背景，這可能是因為脫脂奶粉和BSA自身具有的一定的堿性磷酸酶活性造成的結果[23]。為消除內源性的堿性磷酸酶活性，選擇酪蛋白作為封閉劑，成功降低顯色背景，驗證多克隆抗體的特異性[24]。

ArMV是世界上一種重要的植物病害，本研究構建ArMV CP基因原核表達載體，制備ArMV CP蛋白的多克隆抗體，可以為ArMV的血清學檢測和致病機理的研究提供一定參考。