青格爾，于曉芳，高聚林，胡萬吉，王志剛，孫繼穎，胡樹平,

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)作物栽培與遺傳改良重點實驗室，呼和浩特 010019；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 職業(yè)技術學院,內(nèi)蒙古包頭 014100)

提升耕地質量是中國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障。秸稈還田是培肥地力的有效措施之一[1-2]，玉米秸稈原位生物腐解是促進北方低溫地區(qū)還田玉米秸稈快速分解并生成高質量腐解產(chǎn)物的有效途徑。而玉米秸稈中的木質纖維素成分難以快速分解是限制秸稈生物轉化和資源化利用的關鍵技術瓶頸[3]，針對這一問題，國內(nèi)外學者不斷探索和優(yōu)化新的秸稈纖維素轉化和利用技術，其中秸稈生物降解技術是有效促進作物秸稈分解進程的新途徑，國內(nèi)外很多學者從自然界中篩選獲得了大量的纖維素分解菌[4-5]，及含有多種功能微生物具有較高的代謝和增殖能力并且能分泌多種酶的復合菌系[6-8]。但關于木質纖維素降解微生物的研究，主要集中在較高溫度下秸稈降解菌系的篩選和應用，而對于低溫高效降解菌的研究相對薄弱，篩選出的高效降解菌系(種)較少。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學玉米科技創(chuàng)新團隊(以下稱本團隊)經(jīng)多年低溫降解菌系篩選應用研究形成了菌系的高效篩選及低溫馴化技術體系，利用該技術篩選出了低溫高效降解菌系GF-20[9]，表現(xiàn)出良好的降解效率。前人研究表明，不同培養(yǎng)條件顯著影響復合菌秸稈降解效率及菌種組成多樣性[10-12]。Maruthamuthu等[13]研究發(fā)現(xiàn)復合菌在不同碳源處理條件下其菌種組成發(fā)生顯著差異，進而影響功能代謝途徑；厲文成等[14]對木薯渣高效降解復合菌系RXS進行氮源優(yōu)化，獲得了廉價氮源培養(yǎng)基。李文哲等[15]研究不同氮源對復合菌系LZF-12發(fā)酵特性，發(fā)現(xiàn)濃度0.5%(雞糞+紅糖)為氮源的條件下可達到良好的分解率。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，秸稈原位還田一般配施氮肥(北方玉米種植區(qū)一般施用尿素)，一是有利于還田秸稈的快速腐解，二是防止土壤微生物繁殖與作物生長競爭氮素[16]。因此秸稈原位生物腐解微生物能否適應其尿素氮源無疑關系到菌系的繼續(xù)開發(fā)和利用。而本團隊經(jīng)長期碳源限制性繼代培養(yǎng)與低溫馴化培養(yǎng)獲得具有良好的秸稈降解特性的復合菌系GF-20是以硫酸銨為氮源[9]。鑒于此，為使復合菌系GF-20的高效降解能力在生產(chǎn)中能更好的發(fā)揮，通過限制性繼代培養(yǎng)研究其尿素氮源適應性，探明不同尿素氮源含量馴化過程中復合菌系菌種組成變化及KEGG(代謝通路)代謝功能的差異，為復合菌系的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術支持，也對其他高效降解菌系的篩選和利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2018年6月—2019年6月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學玉米中心進行。供試復合菌系GF-20為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學玉米中心微生物實驗室篩選馴化的纖維素低溫高效降解復合菌系(編號為N1)[9]，有效活菌數(shù)為≥108CFU/mL，其優(yōu)勢菌屬為纖維弧菌屬(Cellvibrio)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等。玉米秸稈取自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學蒙西綜合試驗站(內(nèi)蒙古包頭市土默特右旗溝門鎮(zhèn))試驗田收獲的玉米秸稈(C/N 為48.98，纖維素、半纖維素和木質素含量分別為50.36%、33.59%和9.65%，全氮 6.67 g/kg，全磷 2.78 g/kg，全鉀 11.48 g/kg)，洗凈烘干后剪成1～2 cm短節(jié)。供試濾紙為Whatman No.1。

1.2 培養(yǎng)條件

基礎培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、CaCO32.0 g、NaCl 0.2 g、蒸餾水 1 L。10 mL 培養(yǎng)基分裝于 25 mL 試管中，貼管內(nèi)壁放入 1 cm×10 cm 濾紙條[9]。玉米秸稈培養(yǎng)基：40 mL 基礎培養(yǎng)基和 1 g 玉米秸稈碳源裝入100 mL三角瓶中,置于 10 ℃恒溫條件下靜置培養(yǎng)。

1.3 試驗設計

試驗以基礎培養(yǎng)基為繼代培養(yǎng)基，復合菌系GF-20以5%(V/V)的接種量接入基礎培養(yǎng)基中，在10 ℃恒溫條件下培養(yǎng)3～7 d，進行尿素馴化處理。在培養(yǎng)基中逐漸添加尿素氮源、同比例減少硫酸銨含量進行繼代培養(yǎng)，當培養(yǎng)基中濾紙條黃化斷裂時間一致時吸取濾紙降解處的培養(yǎng)液，轉接到新的培養(yǎng)基中，如此逐漸增加基礎培養(yǎng)基中尿素的含量，直至將氮源硫酸銨完全替換為尿素。培養(yǎng) 10 代直到濾紙斷裂時間與原氮源培養(yǎng)基斷裂時間一致時停止馴化，分別獲得不同氮源復合菌系，即硫酸銨+尿素分別是 0.2%+0(原始菌系GF-20，N1)、0.16%+0.04%(N2)、 0.12%+0.08%(N3)、0.08%+0.12%(N4)、 0.04%+0.16%(N5)、0+0.2%(N6)，共計6個處理，每處理均 3 次重復，馴化復合菌系氮源適應性。

1.4 測定項目及與方法

1.4.1 MiSeq高通量測序 不同氮源處理菌系培養(yǎng)10 d后，在無菌條件下吸取培養(yǎng)液5 mL，采用細菌基因組DNA提取試劑盒(中國，天根生化科技有限公司)提取各復合菌系的基因組DNA，利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。將基因組DNA送至北京奧維森基因科技有限公司(Allwegene Tech.,Co.,Ltd.,Beijing)完成MiSeq高通量測序，擴增區(qū)域為16Sr RNA，引物為338F和806R，對獲得的數(shù)據(jù)通過序列拼接、過濾和去嵌合體得到優(yōu)化序列，進行OTU聚類及注釋(登錄號SRP17734134-18834151)。

1.4.2 玉米秸稈降解效率 不同氮源處理菌系以 5%的接種量接入玉米秸稈培養(yǎng)基中，在 10 ℃恒溫條件下培養(yǎng)30 d后，采用失重法測定玉米秸稈降解率，采用DNS法測定濾紙酶活性和內(nèi)切酶活性，3次重復。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用QIIME(v1.8.0)軟件以97%相似度水平將序列進行聚類物種分類的OTU(Operational Taxonomic Units)，獲得物種分類水平的比例信息及不同分類水平的群落結構；通過Uclust(Version 1.8)、Usearch(Version 8.1.1861)等數(shù)據(jù)庫進行物種比對，得到各水平的分類信息，進行樣本組成及樣本間群落結構差異相關分析、ANOSIM相似性分析、共線性網(wǎng)絡圖分析和PCA分析；采用R(v 3.1.1)繪制各樣品在各個分類水平的比較圖，基于聚類結果，進行Alpha多樣性覆蓋深度、物種豐富度chao1指數(shù)、物種數(shù)、譜系多樣性指數(shù)、香濃指數(shù)分析?；跍y序得到的序列，與KEGG(代謝通路)數(shù)據(jù)庫進行 比對。

2 結果與分析

2.1 不同處理復合菌系alpha多樣性指數(shù)分析

復合菌系多樣性指數(shù)如表1 所示，覆蓋深度指數(shù)均在0.99以上，說明本次高通量測序結果基本能代表樣品的真實情況。物種豐富度Chao1指數(shù)表現(xiàn)為N1～N5處理間無顯著差異，而N6處理顯著低于其他處理；N2處理物種數(shù)最高為59.93，顯著高于N1、N5和N6處理；譜系多樣性指數(shù)則N2顯著高于其他處理，為6.14，N6顯著低于其他處理，為4.18；香濃指數(shù)表現(xiàn)為N2顯著高于其他處理，為4.35，N1顯著低于其他處理。綜合各處理alpha多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，N2處理alpha多樣性指數(shù)較其他處理高，說明其物種組成更加豐富和多樣。

表1 復合菌系alpha多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indexof bacteria microbiome alpha

2.2 不同處理復合菌系細菌物種豐度及其差異分析

對各處理復合菌測序結果進行物種比對，得到各水平的分類信息。門分類水平變形菌門(Proteobacteria)在所有處理中豐富度最高，其次為擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。為探明不同氮源處理對復合菌菌種組成豐度的影響程度，采用組間顯著性差異檢驗分析物種差異，結果如表2所示，不同氮源處理復合菌系物種組成豐度具有顯著差異，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍細菌門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和綠菌門(Chlorobi)豐度均存在極顯著差異。變形菌門相對含量在N3和N4間差異不顯著，豐度分別為85.52%、 87.34%和83.88%，N2和N5條件下豐度顯著低于其他處理，豐度分別為52.33%和66.14%；N2條件下擬桿菌門的相對豐度顯著高于其他處理，豐度為37.01%，N3～N5間豐度差異不顯著；N5條件下放線菌門豐度顯著高于其他處理，為 26.11%；在N2條件下藍細菌門豐度顯著高于其他處理，為9.08%。

表2 不同氮源處理條件下復合菌系門水平細菌群落豐度Table 2 Bacteria community abundance of phylumlevel under different nitrogen conditions %

屬分類水平(表3)，各處理復合菌主要由纖維弧菌(Cellvibrio)、固氮螺菌(Azospirillum)、黃桿菌(Flavobacterium)、土地桿菌屬(Pedobacter)、假單胞菌(Pseudomonas)、纖維單胞菌(Cellulomonas)等組成，但其豐度具有顯著差異。選擇豐度前20的屬進行差異分析發(fā)現(xiàn)，不同氮處理條件下除德沃斯氏菌(Devosia)和Pleomorphomonas外，其余屬豐度均存在顯著差異，纖維弧菌、固氮螺菌和Fluviicola相對含量在N1處理條件下顯著高于其他處理，豐度分別為 74.54%、7.40%和3.78%，而在N5條件下豐度顯著低于其他處理；假單胞菌在混合氮源N3和N4條件下豐度顯著高于其他處理，為55.72%和 56.72%；纖維單胞菌、Niveispirillum、食酸菌(Acidovorax)和氫噬菌(Hydrogenophaga)在N5條件下豐度分別為25.98%、28.11%、 10.97%和 6.36%顯著高于其他處理；Taibaiella、產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacterium)和Dysgonomonas的豐度在N2條件下顯著高于其他處理，豐度分別為5.42%，3.71%和2.35%；短波單胞菌(Brevundimonas)、黃桿菌(Flavobacterium)和無色桿菌(Achromobacter)在N6條件下豐度顯著高于其他處理，豐度分別為 18.52%、 12.80%和12.56%。由此可知，不同氮源處理條件下，各復合菌系間物種存在顯著差異，說明不同的外界營養(yǎng)條件會影響復合菌系的物種組成豐度。

表3 不同氮源處理條件下復合菌系屬水平細菌群落豐度Table 3 Bacteria community abundance of guans level under different nitrogen conditions %

2.3 不同處理復合菌系物種ANOSIM相似性分析

利用共線性網(wǎng)絡圖分析法直觀顯示不同氮處理復合菌系菌種組成相似性及重疊情況。結果如圖1所示，所有處理中重合的菌屬數(shù)目是32個，主要分布在纖維弧菌(Cellvibrio)、假單胞菌(Pseudomonas)、纖維單胞菌(Cellulomonas)、黃桿菌(Flavobacterium)、無色桿菌(Achromobacter)、土地桿菌(Pedobacter)、短波單胞菌(Brevundimonas)、德沃斯氏菌(Devosia)、食酸菌(Acidovorax)、固氮螺菌(Azospirillum)等中，差異菌屬豐度均低于0.01%。為探明不同氮源處理復合菌菌種組成的相似性，采用4種不同的距離計算方法計算屬水平的群落相似性，結果如表4所示，不同計算方法均顯示群落結構存在顯著差異(P< 0.05)，并具有較高的解釋度，再次驗證在不同尿素氮源含量條件下，復合菌系菌種組成豐度存在差異。

表4 不同氮處理復合菌系ANOSIM相似性分析Table 4 ANOSIM analysis of microbial consortia under different nitrogen conditions

2.4 不同處理復合菌系物種組成及功能PCA分析

基于不同處理物種屬水平組成及豐度和KEGG功能分布，計算不同處理間的距離結果如圖2-A、圖2-B所示，第一、二主成分的貢獻率分別是59.4%、28.7%和74.2%、19.1%，其中N2和N6處理距離較近，N3和N4距離較近，說明其物種組成及功能較為相似；而N1和N5分布均較分散，說明其物種組成豐度和功能差異較大。物種組成多樣性決定功能特性，物種的組成及豐度的差異性導致功能多樣性。

2.5 不同處理復合菌系KEGG功能差異分析

各處理復合菌系選取KEGG 第二水平功能注釋結果發(fā)現(xiàn)，碳水化合物代謝和氨基酸代謝豐度較大，均在12%和9%以上(圖3)。為了探明純硫酸銨處理(N1)和純尿素處理(N6)對復合菌功能多樣性的影響，選取KEGG第三水平碳水化合物代謝進行差異分析(圖4)，結果表明戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化、磷酸戊糖途徑、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、淀粉和蔗糖代謝和抗壞血酸鹽和藻酸鹽代謝等代謝通路豐度呈N1顯著高于N6，其余代謝呈N6顯著高于N1，說明不同氮處理可顯著影響復合菌系的功能代謝注釋豐度。

2.6 不同處理復合菌系秸稈降解效率

由表5可知，玉米秸稈降解率在N2處理條件下顯著高于其他處理，而N1和N6處理間無顯著差異；濾紙酶和內(nèi)切酶表現(xiàn)為N1、N3、N4、N5和N6間無顯著差異。說明復合菌系雖然在尿素馴化過程中菌種組成豐度和KEGG代謝豐度存在差異，但在純硫酸銨和尿素條件下秸稈降解性能無顯著差異，復合菌通過協(xié)同代謝完成木質纖維素的降解，對尿素氮源具有良好的適應性和穩(wěn)定性。

表5 不同氮源處理條件下復合菌系秸稈降解率及酶活性Table 5 Straw degradation and cellulase under different nitrogen conditions

3 討 論

目前，針對秸稈降解菌篩選馴化多集中在中高溫功能菌系/菌株，而針對北方寒旱區(qū)玉米秸稈原位還田促腐功能菌系研究較少，且生產(chǎn)實踐中秸稈還田往往配施尿素調(diào)節(jié)碳氮比，因此有必要探明菌系對氮源的適應性及其菌種組成結構，以提高降解菌系的穩(wěn)定性和適應性。因此，試驗以本團隊已篩選出的低溫高效降解復合菌系 GF-20為對象，開展尿素氮源馴化，探明不同尿素氮源含量條件下復合菌系菌種組成和功能豐度及其差異性。

3.1 不同氮源處理條件下復合菌系細菌群落組成及功能分析

根據(jù)共線性網(wǎng)絡方法分析統(tǒng)計不同氮源處理條件下復合菌中所共有屬水平數(shù)目是32，其中各處理平均豐度高于2%的菌屬有纖維弧菌、假單胞菌、纖維單胞菌、黃桿菌、無色桿菌、土地桿菌、短波單胞菌、德沃斯氏菌、食酸菌、固氮螺菌等。纖維弧菌屬菌是典型的纖維素降解菌，可分泌多種纖維素和半纖維素降解酶系，降解羧甲基纖維素、纖維素、半纖維素、幾丁質等[17-18]，其中Cellvibriomixtus屬于產(chǎn)纖維素酶類的兼性厭氧微生物，分泌的纖維素酶屬于典型的低溫纖維素酶[19]；假單胞菌屬的許多種因其有氧降解能力，分泌胞外酶(蛋白酶和脲酶水平很高)，參與復雜碳水化合物的代謝[20]；食酸菌屬也常存在于秸稈降解復合菌中，具有秸稈降解功能[21]；許多纖維單胞菌屬的細菌應用于秸稈生物降解和生物修復領域，分泌的纖維素酶活性高[21-23]；土地桿菌和黃桿菌大多源自于土壤，可利用秸稈降解中間代謝產(chǎn)物促進秸稈分解，分泌過氧化氫酶、氧化酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶等，利用丙酸、乳酸等秸稈降解中間產(chǎn)物，消除底物反饋抑制作用，可利用碳水化合物、醇類和糖苷類等[24-27]；司美茹等[28]和唐玉斌等[29]從被石油污染的土壤和焦化污泥中分離出無色桿菌屬的菌，幾乎能徹底降解C12-C23 和C27-C43的烷烴和多環(huán)芳香烴，能氧化木糖，具有過氧化氫酶和氧化酶活性；德沃斯氏菌屬能分泌過氧化氫酶，利用木糖、戊醛糖、纖維素等[30-31]；短波單胞菌屬可分泌葡萄糖苷酶等纖維素酶，參與秸稈物質的降解[32]；固氮螺菌屬一般與Niveispirillum菌屬協(xié)同發(fā)揮降解作用[33]。各處理復合菌系KEGG預測功能主要為碳水化合物代謝和氨基酸代謝。綜上說明，在不同尿素氮源含量條件下，復合菌系仍保持了較多的功能微生物，復合菌GF-20具有良好的適應性，促進秸稈的分解。

3.2 不同氮源處理條件下復合菌系細菌組成及功能差異分析

根據(jù)ANOSIM相似性分析以及差異性分析表明在不同氮源條件下，復合菌的菌種組成及其豐度均存在一定的差異性。纖維弧菌在N1處理中豐度為74.54%，在N6中為31.13%，而在N5中豐度僅僅為0.81%，說明在單種氮源條件下尤其是在硫酸銨氮源條件下豐度較高；假單胞菌屬更多的參與信號轉導等，促進木質纖維素的降解，其在混合氮源N3、N4條件下豐度顯著高于其他處理，說明其更加適應于混合氮源環(huán)境；纖維單胞菌是典型的纖維素分解菌，常用于菌劑的研制，其豐度在N5條件下較高，說明尿素含量偏高的混合氮源有利于其生長；黃桿菌、無色桿菌和短波單胞菌在N1中豐度僅為1.40%、0.08%和 0.03%，在N6中為12.80%，12.56%和 18.52%，說明尿素為唯一氮源促進其生長。食酸菌、固氮螺菌等豐度高于0.1%的屬在N1和N2中存在，但N6中未檢測到，可能是由于以上菌屬不能以尿素為唯一氮源，在繼代過程中逐漸被淘汰或含量顯著降低。不同氮源處理復合菌系間，N2處理alpha多樣性指數(shù)顯著高于其他處理，菌種組成多樣較高。結構決定功能，不同氮源處理導致復合菌系菌種組成豐度存在差異，導致注釋功能豐度PCA分布存在差異，N2、N6和N3、N4距離較近。不同氮源處理條件下復合菌系功能代謝較相似，其中碳水化合物代謝注釋豐度較大(KEGG中12%以上)，說明各處理復合菌系中含有大量可降解秸稈類木質纖維素生物質的微生物，這與文獻報道的秸稈降解微生物代謝通路類似[6,34]，且在N1和N6處理條件下KEGG碳水化合物第3水平代謝通路注釋豐度存在顯著差異，不同培養(yǎng)條件影響復合菌系菌種組成，進而影響代謝。李鋒[35]和Alessi等[36]研究表明在不同培養(yǎng)條件下，碳水化合物代謝表達具有差異，復合菌通過協(xié)同多種代謝途徑完成木質纖維素的 降解。

4 結 論

在不同尿素氮源含量條件下，復合菌系菌種組成相似，保持了較多的關鍵功能菌，但菌種組成豐度顯著，其中N2處理(硫酸銨和尿素含量為 0.16+0.04%)復合菌的alpha多樣指數(shù)較高。不同處理間菌種豐度差異主要體現(xiàn)在變形菌門和擬桿菌門的纖維弧菌、假單胞菌、纖維單胞菌、黃桿菌等菌屬中，物種組成差異主要體現(xiàn)在Solitalea、指孢囊菌屬(Dactylosporangium)等豐度較低的物種中。不同處理復合菌中碳水化合物代謝和氨基酸代謝注釋豐度較高，其中N1和N6處理間碳水化合物代謝通路豐度存在顯著差異，但玉米秸稈降解效率無顯著差異。