張高原，丁 謙，魏兵強

(1.甘肅農業(yè)大學 園藝學院，蘭州 730070；2.濰坊工程職業(yè)學院 花卉學院，山東青州 262500)

磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(PIP5K)是磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)信號轉導途徑中的關鍵酶，在多種細胞的功能發(fā)揮方面起著重要調控作用[1]。大多數(shù)PIP5K蛋白的N端具有多個MORN(Membrane Occupation and Recognition Nexus)結構域，C端具有1個起催化功能的PIPKc結構域，這些結構域在真核生物中高度保守[2-3]。研究表明，PIP5K基因對植物的多個組織器官的發(fā)育起調控作用，如氣孔[4]、根[5-7]、花[8-11]等；此外，還參與調控植物逆境脅迫響應，如鹽害[12]、水分脅迫[13]等。目前，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、銀杏(Ginkgobiloba)和大豆(Glycinemax)中分別發(fā)現(xiàn)11、11、7和22個PIP5K基因[14]，部分基因已被克隆。

雖然西瓜基因組數(shù)據(jù)已公布[15]，但是關于西瓜PIP5K基因的鑒定及其在雄性不育花蕾中的表達分析未見相關報道。本試驗擬利用生物信息學方法對西瓜PIP5K基因進行篩選和鑒定，并對其蛋白理化性質、結構域、基因結構、motif分布、染色體定位、進化樹、共線性、順式作用元件等特征以及組織表達模式進行分析，以期為進一步研究其功能奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 西瓜花蕾材料

西瓜雄性兩用系中可育系‘MF-1’和不育系‘MS-1’種子均由甘肅農業(yè)大學瓜類研究所提供。種子于2020年4月22日播種于蘭州市皋蘭縣忠和鎮(zhèn)實試驗田，于7月8日分別采取雄性可育株和不育株的子蔓莖尖花蕾(長度為3～5 mm)和莖尖下方4～5節(jié)處花蕾(長度為7～9 mm)，每種花蕾至少采集30個，儲存在液氮中保存，備用。

1.2 西瓜PIP5K家族成員的獲取

首先從西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/ watermelon/97103/v1/)[15]下載蛋白組和基因組序列，其次利用Blast本地化軟件(Blast2.2.28)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)構建西瓜蛋白組和基因組數(shù)據(jù)庫，然后以Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)[16]中的PIP5K保守結構域的隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model; HMM)文件(序列號為PF01504)為搜索序列，利用HMMER 3.2軟件(http://www.hmmer.org/)[17]在本地西瓜蛋白組數(shù)據(jù)庫中進行BlastP搜索，閾值為E-value<10-10，獲取西瓜PIP5K候選成員。為確保候選成員中含有PIPKc結構域,利用SMART (http://smart.embl.de/)在線軟件鑒定西瓜PIP5K候選成員。最后從本地西瓜蛋白組和基因組數(shù)據(jù)庫中下載鑒定后的西瓜PIP5K家族成員的蛋白和基因序列，作為后期分析的基礎。擬南芥PIP5K成員[14]的基因和蛋白序列來源于擬南芥數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/)。

1.3 西瓜PIP5K家族成員基本信息分析

蛋白序列長度、分子量及等電點等理化特征利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件進行分析。亞細胞定位分別利用Euk-mPLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)[18]和ProtComp version 9.0 server(http://www.softberry.com)進行分析。根據(jù)基因序列起始位點，利用MapChart 2.2軟件繪制西瓜PIP5K基因染色體分布圖。利用MCScanX軟件(http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/)[19]進行西瓜和擬南芥PIP5K基因的共線性分析，結果用circos軟件(http://circos.ca/)繪制[20]。進化樹由MEGA-X軟件[21]構建，序列比對方法均為ClustalW，Bootstrap的重復次數(shù)設置為1 000，其中西瓜PIP5K家族成員的蛋白和編碼序列進化樹的構建方法均為鄰接法(Neighbor-joining，NJ)，執(zhí)行參數(shù)分別為p-distance和pairwise deletion[22-24]，剩余設置選擇默認選項；擬南芥和西瓜PIP5K家族成員的蛋白和編碼序列系統(tǒng)進化樹的構建方法均為最大似然法(Maximum Likelihood，ML)，執(zhí)行參數(shù)分別為Jones-Taylor-Thornton(JTT) model、Gamma Distributed (G)和Use all sites[24]，剩余設置選擇默認選項。利用OrthoFinder 2.3.11軟件[25](http://www.steve-kellylab.com/software/orthofinder)分析擬南芥和西瓜PIP5K基因家族之間的直系同源基因和旁系同源基因。利用MEME 5.1.1軟件[26](http://meme-suite.org/)對PIP5K蛋白序列進行motif分析，其中motif基序長度范圍為6～50，數(shù)量最大為10，然后利用WebLogo 3.7.4(http://weblogo.threeplusone.com/)生成motif基序標簽[27]。利用GSDS2.0(Gene Structure Display Server)(http://gsds.gao-lab.org/index.php)進行基因結構分析[28]。截取西瓜PIP5K編碼基因上游2 000 bp序列，利用PlantCARE軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件分析[29]，結果用Evolview v2繪制[30]。

1.4 西瓜PIP5K家族成員轉錄組分析

利用NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載西瓜栽培品種97103的生長點、果柄、果肉、下胚軸、葉和根相關的RNA-seq數(shù)據(jù)(SRP192188)[31]，然后利用HISAT 2.2.0軟件[32](https://daehwankimlab.github.io/hisat2/)進行RNA-seq分析，R語言的 Rsubread包的featureCounts進行TPM(Transcripts Per Million)表達定量分析[33-34]。

1.5 西瓜花蕾材料的采集及表達分析

利用TRNzol Universal總RNA提取試劑(TIANGEN,中國北京)提取西瓜雄性可育和不育花蕾總RNA。利用PrimeScriptTM RT試劑盒(TaKaRa,中國大連)合成cDNA。利用Primer 5.0設計西瓜PIP5K基因以及內參基因 (β-actin; Cla007792)的特異性引物(表1)。采用羅氏 LightCycler96 實時熒光定量PCR儀(Roche,Basel,Switzerland)進行基因表達量檢測。Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)反應體系如下：10 μL SYBR Green Master mix (2×)，0.8 μL primer F(10 μmol/L)，0.8 μL primer R(10 μmol/L)，6.4 μL ddH2O和2 μL cDNA模板。PCR反應程序如下：95 ℃預變性30 s,然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s 進行50個循環(huán)。以雄性可育花蕾(長度為3～5 mm)為對照，計算其他花蕾中ClaPIP5K基因相對表達量，設置3次重復，計算方法采用2-△△Ct方法[35]。采用SPSS17軟件中的t檢驗對基因表達量進行統(tǒng)計分析。

表1 西瓜 PIP5K基因的qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers of watermelon PIP5K genes

2 結果與分析

2.1 ClaPIP5K成員的染色體定位和共線性分析

西瓜基因組中共鑒定出8個PIP5K家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置進行編號 (ClaPIP5K1～ClaPIP5K8)。結果如圖1-A所示，西瓜數(shù)據(jù)庫中將無法定位的染色體片段組合起來稱為0號染色體，除了ClaPIP5K1定位在0號染色體外，其余7個ClaPIP5K基因分布在其他6條染色體上，其中5號染色體分布2個ClaPIP5K基因，其他5條染色體分別分布1個ClaPIP5K基因。為了檢測ClaPIP5K和AtPIP5K基因間的進化關系，利用MCScanX軟件進行共線性分析。結果如圖1-B所示，4個ClaPIP5K基因與5個擬南芥AtPIP5K基因存在共線關系，如ClaPIP5K7分別與AtPIP5K6、AtPIP5K9和AtPIP5K10共線，ClaPIP5K8分別與AtPIP5K1和AtPIP5K2共線，ClaPIP5K3與AtPIP5K2共線；此外，1個ClaPIP5K基因對(ClaPIP5K5～ClaPIP5K7)發(fā)生片段復制事件。

2.2 ClaPIP5K成員的蛋白和基因信息

ClaPIP5K基因的CDS序列長度為606～ 2 499 bp，蛋白序列長度為201～832 aa，分子質量為22.62～93.76 ku，等電點介于6.6～ 8.87，其中4個蛋白呈堿性(表2)。亞細胞定位分析顯示多數(shù)ClaPIP5K蛋白位于細胞質或細胞膜上(表2)。蛋白結構域分析顯示，所有的ClaPIP5K成員在C端都具有1個起催化功能的PIPKc結構域，其中6個ClaPIP5K成員在N端還具有 7～8個MORN結構域(圖2)。

表2 西瓜PIP5K家族成員的基本信息Table 2 Information of PIP5K family members in watermelon

2.3 ClaPIP5K成員的蛋白序列進化樹及保守基序分析

為了檢測ClaPIP5K和AtPIP5K成員的蛋白序列進化情況以及同源序列對(組)所包含的保守基序數(shù)量及種類，利用MEGA X軟件進行進化樹分析，Orthofinder軟件進行同源序列分析，MEME軟件進行保守基序分析。結果如圖3所示，蛋白序列進化樹顯示ClaPIP5K和AtPIP5K成員被分成4個組(GroupⅠ～Ⅳ)，其中 GroupⅠ所含成員最多，為6個，GroupⅡ和Ⅲ次之，分別為5個，GroupⅣ最少，為3個。蛋白保守基序分析顯示ClaPIP5K蛋白中含有10個保守基序，每個保守基序含有29～50個氨基酸，其中motif1、4、5和7所含氨基酸數(shù)量最多，平均為50個，motif10所含最少，為29個。此外，GroupⅠ～Ⅲ亞組中，除了ClaPIP5K1和AtPIP5K3外，其他PIP5K成員中均含有10個motif。同源序列分析發(fā)現(xiàn)ClaPIP5K和AtPIP5K之間存在5個同源序列對(組)，其中4個同源序列對(組)(ClaPIP5K4/AtPIP5K4/AtPIP5K5、ClaPIP5K3/ClaPIP5K8/AtPIP5K1/AtPIP5K2、ClaPIP5K7/AtPIP5K9和ClaPIP5K2/ ClaPIP5K6)所含 motif數(shù)量和種類均相似。而ClaPIP5K1和ClaPIP5K5由于部分氨基酸的缺失，導致其motif種類和數(shù)量上與同組的AtPIP5K成員有所差異。

2.4 ClaPIP5K成員的基因序列進化樹及基因結構分析

為了檢測ClaPIP5K和AtPIP5K成員的基因序列進化情況以及同源序列的內含子和外顯子分布情況，利用MEGA X軟件進行進化樹分析，Orthofinder軟件進行同源序列分析，GSDS軟件進行基因結構分析。結果如圖4所示，基因序列的系統(tǒng)進化樹和同源序列分析結果與蛋白序列的(圖3)基本一致；基因結構分析顯示75%(6/8)ClaPIP5K基因含有7個內含子(圖4)，并且4個同源序列對(組) (ClaPIP5K4/AtPIP5K4/AtPIP5K5、ClaPIP5K3/ClaPIP5K8/AtPIP5K1/AtPIP5K2、ClaPIP5K7/AtPIP5K9和ClaPIP5K2/ClaPIP5K6)所含內含子數(shù)量均為7個。另外，與AtPIP5K6相比，ClaPIP5K2和ClaPIP5K6的第一個內含子發(fā)生了缺失現(xiàn)象，ClaPIP5K1和ClaPIP5K5出現(xiàn)了部分內含子和外顯子的缺失現(xiàn)象，導致與同組的AtPIP5K基因在基因結構上有所差異。

2.5 ClaPIP5K成員的順式作用元件分析

為了明確ClaPIP5K基因啟動子所含的順式作用元件種類及分布情況，利用PlantCARE軟件進行分析。結果如圖5所示，ClaPIP5K基因啟動子處主要包含2大類順式作用元件：①激素響應元件，如響應生長素IAA的AuxRR-core(1/8；含元件基因數(shù)/總基因數(shù)，下同)，響應赤霉素GA 的TATC-box(1/8)、GARE-motif(2/8)和P-box(4/8)，響應水楊酸SA 的TCA-element(5/8)，響應脫落酸ABA的ABRE(4/8)和響應茉莉酸甲酯MeJA的CGTCA-motif(3/8)等元件；②脅迫響應元件，如響應干旱的MYB結合位點MBS(5/8)，響應低溫的LTR(4/8)，響應防御與脅迫的TC-richrepeats(5/8)，厭氧誘導的ARE(7/8)和響應損傷的WUN-motif(6/8)等元件。其中ClaPIP5K4基因所含順式作用元件種類和數(shù)量最多，共9種16個(1個AuxRR-core、1個GARE-motif、1個TCA-element、2個ABRE、1個CGTCA-motif、1個LTR、1個TC-richrepeats、7個ARE和1個WUN-motif)，ClaPIP5K3所含順式作用元件種類和數(shù)量最少，共3種6個(1個MBS、4個ARE和1個WUN-motif)。另外，ClaPIP5K2和ClaPIP5K6所含順式作用元件種類和數(shù)量較相似。

2.6 ClaPIP5K基因在不同組織中的表達模式分析

為探索ClaPIP5K基因在西瓜生長發(fā)育過程中潛在的生物學功能，對已公布的西瓜栽培品種97103的生長點、果柄、果肉、下胚軸、葉和根的RNA-seq數(shù)據(jù)進行組織表達模式分析。結果如表3所示，4個ClaPIP5K基因在6個組織的不同發(fā)育時期表現(xiàn)出較高的表達量(TPM>10)，其中ClaPIP5K1基因在授粉34 d后的生長點中表達量最高，ClaPIP5K3基因在授粉18 d后的葉片中表達量最高，ClaPIP5K8和ClaPIP5K7基因分別在授粉10 d和26 d后的果肉中表達量最高。此外，ClaPIP5K5基因僅在生長點的4個時期表現(xiàn)出較高的表達量，具有明顯的組織表達特異性。另外，本試驗利用qRT-PCR技術檢測了ClaPIP5K基因在西瓜雄性可育和雄性不育花蕾中的表達分析。結果如圖6所示，西瓜雄性可育植株花蕾和花藥發(fā)育正常、飽滿(圖6-A)，而不育植株花蕾和花藥發(fā)育不正常、干癟(圖6-B)；另外，基因表達分析中(圖6-C)，除了ClaPIP5K5基因外，其他7個ClaPIP5K基因在西瓜雄性可育和不育花蕾中均檢測出不同程度的表達量。其中，與可育植株的7～9 mm長的花蕾對比后發(fā)現(xiàn)，4個ClaPIP5K基因(ClaPIP5K1、ClaPIP5K3、ClaPIP5K7和ClaPIP5K8)在不育花蕾中具有明顯的較高表達量，然而ClaPIP5K2表現(xiàn)出明顯的較低表達量；此外，在3～5 mm和7～9 mm長的花蕾中，ClaPIP5K4基因在不育花蕾的表達量均明顯低于可育花蕾，然而ClaPIP5K6基因出現(xiàn)相反的表達趨勢。以上結果表明ClaPIP5K基因可能在西瓜生長點、葉片、果肉以及花蕾花藥等組織生長發(fā)育方面具有重要作用。

表3 ClaPIP5K基因在西瓜栽培品種‘97103’的不同組織中的表達分析Table 3 Expression analysis of ClaPIP5K genes in different tissues of watermelon cultivar ‘97103’

3 討論與結論

磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(PIP5K)是植物內一種磷酯類激酶，在不同植物中的成員數(shù)量有所不同。擬南芥中發(fā)現(xiàn)含有11個PIP5K成員，大致分成4組(Ⅰ～Ⅳ)。除了第Ⅳ組含有2個AtPIP5K成員外，其他組均含有3個。西瓜含有8個ClaPIP5K成員，除了第Ⅰ組所含ClaPIP5K成員數(shù)量與擬南芥一樣外，其他組的數(shù)量均比擬南芥的少1個，說明這3組(Ⅱ～Ⅳ)的ClaPIP5K成員在進化過程中出現(xiàn)了缺失現(xiàn)象。除了C端具有起催化功能的PIPKc結構域外，N端多MORN結構域也是植物大多數(shù)PIP5K家族成員所特有的特征[2-3]。例如，擬南芥中有9個AtPIP5Ks具有7～8個MORN結構域，水稻中有5個OsPIP5Ks 具有7～8個MORN結構域[2]，而西瓜中也發(fā)現(xiàn)6個ClaPIP5K成員具有7～8個MORN結構域(圖1)。亞細胞定位預測顯示多數(shù)ClaPIP5K定位在細胞質或細胞膜上，說明這些基因可能在細胞質或細胞膜上行使其功能。以前的研究也證實了PIP5K基因作為一種細胞膜傳感器，在磷脂類代謝中發(fā)揮著重要作用[36]。

通過進化樹、同源序列、保守基序和基因結構等分析，發(fā)現(xiàn)位于同一組的擬南芥和西瓜PIP5K成員在保守基序種類和基因結構上具有高度的相似性。例如4個同源序列對(組) (ClaPIP5K4/ AtPIP5K4/ AtPIP5K5、ClaPIP5K3/ ClaPIP5K8/ AtPIP5K1/ AtPIP5K2、 ClaPIP5K7/AtPIP5K9和 ClaPIP5K2/ ClaPIP5K6)都具有10個motifs和7個內含子。但是也發(fā)現(xiàn)了一些差異，如AtPIP5K6與 ClaPIP5K2/ ClaPIP5K6的motif種類分布上相似，但由于AtPIP5K6在N端多了1個內含子，其基因結構與 ClaPIP5K2/ ClaPIP5K6有所不同； ClaPIP5K1和ClaPIP5K5由于大量序列的丟失，導致與同組的AtPIP5K在保守基序分布和基因結構上差異較大。以上結果表明多數(shù)PIP5K成員在進化過程中相對保守。

基因復制事件在基因家族成員數(shù)量擴增、生物多樣性和物種形成等方面具有重要作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，4個ClaPIP5K基因與5個擬南芥AtPIP5K基因存在復制情況，1個ClaPIP5K基因對(ClaPIP5K5-ClaPIP5K7)存在片段復制現(xiàn)象，說明全基因組復制或者片段復制在ClaPIP5K基因復制中扮演著重要作用。

啟動子分析顯示ClaPIP5K基因含有響應IAA、GA、ABA、SA、MeJA等激素以及干旱、低溫等非生物脅迫等方面的順式作用元件，這與玉米PIP5K基因啟動子生信分析結果相似[37]?；谝压嫉奈鞴蟁NA-seq數(shù)據(jù)，分析了ClaPIP5K基因在不同組織的不同發(fā)育時期的表達模式。結果顯示4個ClaPIP5K基因 (ClaPIP5K1、ClaPIP5K3、ClaPIP5K7和ClaPIP5K8)在生長點、果柄、果肉、下胚軸、葉和根的不同發(fā)育時期均表現(xiàn)出較高的表達量，而ClaPIP5K5只在生長點表現(xiàn)出較高的表達量，說明ClaPIP5K基因可能協(xié)同或者單獨地參與調控西瓜不同組織形態(tài)建成相關途徑。此外，以前研究表明擬南芥AtPIP5K4或AtPIP5K5缺失突變株的花藥和花粉發(fā)育受到嚴重抑制[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)ClaPIP5K4基因在雄性不育花蕾發(fā)育的 2個階段中一直維持著顯著的低表達量狀態(tài)，并且ClaPIP5K4與AtPIP5K4和AtPIP5K5為同源基因，表明ClaPIP5K4基因可能參與調控西瓜花藥或花粉的生長發(fā)育。總之，本研究首次利用生物信息學方法對西瓜PIP5K基因家族進行了鑒定，包括蛋白理化性質、結構域、保守基序、基因結構、進化情況、啟動子以及組織表達模式等方面的分析，為后期研究其功能奠定了一定基礎。