袁捷，王肅，姜云生，胡忠慧

（天津市第五中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津 300450）

胰島β細(xì)胞合成和分泌的胰島素是維持人血糖穩(wěn)態(tài)、新陳代謝、生殖、生理所必須的內(nèi)分泌激素。在糖尿病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，胰島細(xì)胞的功能不斷下降。不管是在糖尿病的發(fā)生機(jī)制中還是在糖尿病的進(jìn)展過程中都會(huì)發(fā)生胰島β細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，不論是Ⅰ型糖尿病[1]還是Ⅱ型糖尿病[2]，患者胰腺內(nèi)的胰島細(xì)胞數(shù)量都會(huì)發(fā)生異常的減少。因此，如果能夠有效阻止糖尿病患者胰腺內(nèi)的胰島細(xì)胞的異常凋亡，可延緩糖尿病進(jìn)程。

丹酚酸B（SalB）是一種從唇形科植物丹參中純化的天然產(chǎn)物，有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等[3-4]多種藥理活性。有報(bào)道表明，SalB對胰島細(xì)胞系的損傷有保護(hù)作用[5]，然而其作用機(jī)制尚不明確。本研究制備鏈脲佐菌素（STZ）損傷的大鼠胰島團(tuán)體外模型，考察SalB是否抑制STZ誘導(dǎo)的胰島凋亡，并且進(jìn)一步探討PI3K/Akt通路在這一現(xiàn)象中的可能機(jī)制，為進(jìn)一步將SalB開發(fā)為治療糖尿病的藥物提供基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 儀器 NU-4750E二氧化碳培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司）；TG16-WS/TG16WS臺(tái)式高速離心機(jī)（中國湘儀集團(tuán)）；Nikon Eclipse E600倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Bio-rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad Laboratories公司）。

1.2 藥品與試劑 鏈尿佐菌素（STZ，Lot：WXBC2044V）、膠原酶 V（Lot No.SLBL6045V）購自 Sigma公司；熒光素二乙酸鹽（FDA，Lot No.1028A025）活細(xì)胞染料、碘化丙錠（PI，Lot No.326C047）購自北京索萊寶科技有 限 公 司 ；TUNEL 凋 亡 檢 測 試 劑 盒（Cat.NO：KGA7062，Lot：20171102）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Rat/Mouse Insulin ELISA試劑盒（96 test，Lot No.2707840）購自EMD Millipore 公司，兔抗大鼠 PI3Kβ 抗體（Lot：AG0933936），購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗Akt抗體和兔抗Phospho-Akt（Ser473）抗體（Lot#2854035）購自 Cell Signaling Technology公司；小鼠抗大鼠mouse anti β-actin mAb 抗體（17AV0409）、horseradish peroxidase（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF，0.45 μm），購自羅氏公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（Lot No：ABA211779）、Histopaque 1077（Lot：RNBD9297），均購自Hyclone公司；青霉素鏈霉素（Pen/Strep 100×，Lot No.510210101100）購自 GENVIEW公司；TBD 優(yōu)級胎牛血清（FBS，Lot：QW20171105-0372）購自天津市灝洋公司；Clarity Western ECL Substrate化學(xué)發(fā)光試劑盒（Control 102030903）購自BioRad公司。

1.3 動(dòng)物健康 雄性SD大鼠（清潔級），體質(zhì)量180～220 g，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自然光照，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.4 大鼠胰島團(tuán)的分離和純化 取體質(zhì)量范圍為200～230 g的正常SD大鼠（雄性），腹腔注射10%烏拉坦麻醉，打開胸腔，以D-Hank’s緩沖液心臟灌流至肺葉變白，打開腹腔，暴露胰腺找到膽總管，經(jīng)膽總管內(nèi)插管并逆行注入預(yù)冷的膠原酶V（1 g/L）溶液8 mL，使胰腺充分膨脹后，迅速取出整個(gè)胰腺，在37℃水浴中靜止消化15 min，直接振搖后加入含有10%FBS的D-Hank’s緩沖溶液終止消化。離心半徑8 cm，1 000 r/min離心10 min后，棄上清液，加入Histopaque1077溶液5mL混勻，再緩慢加入Histopaque 1077溶液10 mL和D-Hank’s液10 mL，離心半徑8 cm，2 000 r/min 離心 15 min，吸出 D-Hank’s和Histopaque 1077層面的胰島團(tuán)用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（RPMI-1640完全培養(yǎng)基含有10%FBS和 1%P/S）。

1.5 分組和給藥 參考文獻(xiàn)SalB給藥劑量[6]，體外培養(yǎng)的胰島團(tuán)分為5組：空白對照組（Control），STZ處理組，STZ+SalB 低劑量（15 μmol/L）組，STZ+SalB中劑量（30 μmol/L）組，STZ+SalB 高劑量（60 μmol/L）組?？瞻讓φ战M的細(xì)胞以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液處理；STZ處理組以8 μmol/L的STZ處理4 h之后換成普通完全培養(yǎng)基；STZ+SalB各劑量組先以STZ處理4 h，換掉STZ溶液，以不同濃度的SalB繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.6 熒光二乙脂/碘丙啶（FDA/PI）雙染檢測胰島細(xì)胞活力 SD大鼠胰島團(tuán)分別用低、中、高劑量SalB處理 72 h，各劑量濃度分別為 15、30、60 μmol/L，通過熒光二乙脂/碘丙啶（FDA/PI）雙染檢測SalB對胰島活性的影響，在熒光顯微鏡下用490 nm激發(fā)光濾光片檢測綠色的FDA熒光（活細(xì)胞），用510 nm激發(fā)光濾光片后檢測紅色的PI熒光（死細(xì)胞）。以冷CCD成像系統(tǒng)采集圖像。

1.7 胰島素水平檢測 各組胰島團(tuán)處理72 h后取上清液，用ELISA法測定，測定方法根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。

1.8 TUNEL法檢測胰島細(xì)胞凋亡 各組胰島團(tuán)于包埋盒中以O(shè)CT包埋劑包埋，置入-80℃冰箱中速凍。冰凍切片機(jī)切片，切片厚度為10 μm。取冰凍切片TUNEL法進(jìn)行染色。冰凍切片以4%多聚甲醛固定30 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次后，3%BSA+0.3%Triton X-100 于室溫下固定、透明 1 h，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作，圖片用Image J軟件分析處理。每張圖片在高倍鏡下取一定視野，計(jì)算胰島細(xì)胞凋亡率（胰島細(xì)胞凋亡率=胰島細(xì)胞凋亡數(shù)/胰島細(xì)胞總數(shù)×100%）。記錄切片大鼠胰島團(tuán)的凋亡率。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）蛋白分析 以RIPA（50 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS） 于 4 ℃裂解胰島30 min，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清蛋白將其分裝后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中保存。BCA法測定蛋白濃度，樣品蛋白按比例稀釋后加蛋白上樣緩沖液（5×）于干式恒溫加熱器上100℃變性10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳。濃縮膠用60 V電壓電泳1 h，將電壓調(diào)到110 V電泳2 h后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗4℃孵育過夜。次日以TBST洗3次后，以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后加上ECL發(fā)光液于BioRad凝膠成像儀曝光獲得蛋白印記。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SalB降低STZ誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡率 大鼠胰島團(tuán)以 STZ（8 mmol/L）處理 4 h，換掉 STZ溶液，以不同濃度的SalB（15、30、60μmol/L）處理 72 h。TUNEL凋亡染色法檢測SalB對STZ誘導(dǎo)的胰島凋亡的保護(hù)作用。如圖1A所示，DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記胰島團(tuán)的細(xì)胞核，TUNEL（紅色）標(biāo)記凋亡的細(xì)胞核。對染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，與空白對照組（Control）比較，STZ 處理的胰島團(tuán)凋亡率顯著上升（12.96±1.53%vs.5.12±0.63%，P＜0.01）。見圖 1B。與 STZ 處理組比較，STZ+SalB中劑量組和高劑量組顯著降低STZ誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡（9.44±0.92%vs.12.96±1.53%，7.7±0.91%vs.12.96±1.53%，P＜0.01。見圖 1B。

圖1 大鼠胰島團(tuán)TUNEL凋亡染色Fig.1 TUNEL apoptotic staining on rat islets

2.2 SalB對正常胰島無損傷作用 為了驗(yàn)證SalB是否對正常的胰島細(xì)胞有損傷作用，以不同SalB濃度（15、30、60 μmol/L）處理大鼠胰島團(tuán)72 h。SalB 處理過的胰島團(tuán)以FDA/PI雙染，F(xiàn)DA（綠色）染色活細(xì)胞，PI（紅色）染色凋亡細(xì)胞。與空白對照組（Control）比較，各劑量SalB組的胰島細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表明 SalB（15～60 μmol/L）對大鼠胰島細(xì)胞無損傷作用。見圖2。

圖2 大鼠胰島團(tuán)FDA/PI染色Fig.2 FDA/PI staining on rat islets

2.3 SalB對胰島素分泌的促進(jìn)作用 以不同SalB濃度 （15、30、60 μmol/L） 處理大鼠胰島團(tuán) 72 h，ELISA法檢測胰島團(tuán)上清液中的胰島素水平。與空白對照組（Control）比較，STZ處理組胰島團(tuán)上清液胰島素水平顯著降低（P＜0.01）。與STZ處理組比較，30、60 μmol/L SalB組的胰島團(tuán)上清液胰島素水平顯著升高（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 ELISA法檢測大鼠胰島團(tuán)的胰島素釋放水平Fig.3 Insulin levels in supernatant of root islets tested by ELISA

2.4 SalB對PI3K/Akt通路的調(diào)控作用 與空白對照組（Control）比較，STZ 處理組 PI3K、Akt和 p-Akt水平顯著下降（P＜0.01）。與STZ處理組比較，SalB（30 μmol/L）組 PI3K 水平升高（P＜0.05），Akt水平無顯著變化（P＞0.05），p-Akt水平顯著升高（P＜0.05）；SalB（60 μmol/L）組 PI3K 水平升高（P＜0.01），Akt水平無顯著變化（P＞0.05），p-Akt水平顯著升高（P＜0.01）。見圖 4。

圖4 丹酚酸B對大鼠PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的作用Fig.4 Effect of Salvianolic acid B on the expression of rat PI3K，Akt and p-Akt proteins

3 討論

SalB有多種藥理學(xué)活性，對血糖波動(dòng)的糖尿病大鼠胰島有保護(hù)作用[7]，并且可以改善2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗[8]。最近的研究表明，SalB對高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用[5，9]。INS-1細(xì)胞是一種大鼠胰島β細(xì)胞系，可用作檢測胰島素分泌。SalB對間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡有抑制作用，并且提高葡萄糖刺激的INS-1細(xì)胞胰島素釋放。無論是Ⅰ型糖尿病還是Ⅱ型糖尿病，共同的病理改變是胰島β細(xì)胞的凋亡和逐漸缺失?；赟alB抑制INS-1細(xì)胞凋亡的報(bào)道，本研究直接提取、純化大鼠胰島團(tuán)，以STZ處理制備體外的胰島團(tuán)損傷模型，并以不同濃度的SalB處理研究其對胰島團(tuán)的整體作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SalB在一定濃度（30、60 μmol/L）下對STZ損傷的大鼠胰島團(tuán)有保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為胰島細(xì)胞凋亡率的下降。值得關(guān)注的是，30和60 μmol/L的SalB直接處理胰島團(tuán)，對胰島團(tuán)無損傷作用，表明SalB有胰島保護(hù)作用的同時(shí)對胰島細(xì)胞沒有傷害。此外，兩種濃度的SalB對胰島團(tuán)分泌胰島素的能力有促進(jìn)作用。

Huang M等[10]研究了SalB對高脂飲食聯(lián)合STZ注射制備的Ⅱ型糖尿病大鼠模型的影響。與模型組比較，口服SalB（100和200 mg/kg）顯著降低血糖并增加胰島素敏感性指數(shù)，然而SalB卻降低了Ⅱ型糖尿病大鼠的胰島素水平。而Raoufi S等[11]的研究中，研究者制備了多次低劑量STZ注射的糖尿病大鼠模型。與模型組比較，腹腔注射SalB（40 mg/kg）可以降低糖尿病大鼠血糖水平之外還可以提高血清胰島素水平，與Huang M等的研究在SalB對胰島素水平的結(jié)論上相反。本研究中，提取純化了大鼠的胰島團(tuán)進(jìn)行體外培養(yǎng)，以STZ處理制備胰島團(tuán)損傷模型，再以不同濃度的SalB處理胰島團(tuán)，觀察其對胰島團(tuán)凋亡、胰島素分泌的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SalB對大鼠體外培養(yǎng)的胰島團(tuán)的胰島素分泌水平有促進(jìn)作用，與Raoufi S等的結(jié)論一致。此外，與在體內(nèi)模型的研究比較，本研究基于離體培養(yǎng)的胰島團(tuán)，便于探索對SalB對胰島抗凋亡作用的機(jī)制。

PIK3/Akt信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程。該通路的激活促進(jìn)下游cIAP-2和XIAP的轉(zhuǎn)錄，參與Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。cIAP-2和XIAP是Caspase的抑制劑，因此PIK3/Akt通路的激活可以有效抑制凋亡程序[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ損傷的大鼠胰島團(tuán)在凋亡水平升高的同時(shí)，PI3K、Akt和p-Akt水平下降。與STZ處理組比較，中劑量和高劑量SalB升高PI3K和p-Akt的水平，表明SalB在一定濃度范圍內(nèi)可以上調(diào)PI3K和p-Akt的水平激活PI3K/Akt通路。然而，SalB對Akt的水平?jīng)]有影響，表明SalB對PI3K/Akt通路的上調(diào)并不通過直接升高Akt蛋白的水平來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，SalB促進(jìn)Akt磷酸化水平激活PIK3/Akt信號(hào)通路，從而抑制大鼠胰島團(tuán)細(xì)胞凋亡。SalB的制備工藝成熟，是一種有潛力治療糖尿病的化合物。