劉宏根，楊佩穎，李小江，賈英杰

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300193）

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，中國(guó)胃癌患者就診時(shí)多伴有淋巴轉(zhuǎn)移，淋巴轉(zhuǎn)移與胃癌預(yù)后密切相關(guān)[1]。淋巴管生成在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，是淋巴轉(zhuǎn)移的重要前提。淋巴管生成相關(guān)因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）-C和VEGF-D是調(diào)控淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)新生淋巴管生成的最重要分子，是反映淋巴管生成的重要指標(biāo)[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)SMYD3（SET and MYND domain-containing protein 3）與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。目前對(duì)于胃癌淋巴轉(zhuǎn)移患者，多采用局部聯(lián)合全身治療。然而現(xiàn)有治療方法對(duì)患者身體損傷很大，因此尋找新的抑制淋巴轉(zhuǎn)移藥物至關(guān)重要。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能及保護(hù)肝腎等生理功能[4]。近些年發(fā)現(xiàn)姜黃素具有潛在抗腫瘤作用，目前報(bào)道在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及減少腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中姜黃素都發(fā)揮重要作用。近些年有學(xué)者通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠發(fā)揮抗淋巴管生成的作用[5]。然而姜黃素抑制胃癌淋巴管機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上探索姜黃素抑制淋巴管生成相關(guān)因子的可能分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物 MGC803細(xì)胞和穩(wěn)定低表達(dá)SMYD3的細(xì)胞（MGC803-sh-SMYD3）購(gòu)于天津時(shí)域科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco BRL公司）中，添加10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）和1%青霉素鏈霉素（美國(guó)Gibco BRL公司），孵育在5%的37℃CO2培養(yǎng)箱中。

SMYD3抑制劑BCI-121（產(chǎn)品號(hào)M01404）和姜黃素（產(chǎn)品號(hào)BP11090）購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司。BCI-121最佳干預(yù)濃度為120 μmol/L[6]，姜黃素濃度為 10、30 和 50 μmol/L[7]。

1.2 MTT 選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后以3 000個(gè)/孔接種于96孔板。24 h待細(xì)胞貼壁以后，加藥物處理，24、48、72和96 h棄藥物培養(yǎng)基，加入200 μL普通培養(yǎng)基，同時(shí)每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，溫箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL/孔，搖床震蕩10 min，至紫色結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR） 總RNA提取試劑盒、DNA第一鏈合成試劑盒均購(gòu)自天津時(shí)域科技有限公司。RNA完整性采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其透過(guò)率與純度采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。以O(shè)ligo-dT15為引物，參照20 μL反應(yīng)體系合成cDNA第一鏈。引物序列由北京百奧萊博科技有限公司合成并提供。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 s；95℃5 s，64℃34 s，40個(gè)循環(huán)。每對(duì)引物設(shè)3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果用ABI PRISM 7500分析，最后計(jì)算2-ΔΔCT值引物序列如下：SMYD3（5′-TCGCAACCGCCAACAGGGGAAACGG/TCCCGAGAAGGCAGCGGTCGCAGAC-3′）；VEGF-C（5＇-GCCCCAAACCAGTAACAATCA/CAGCATCCGAGGAAAACATAAA-3＇）；VEGF-D（5＇-CTGCCTGATGTCAACTGCTTAG/AGATGATCGCTTC ACTGGTCC-3＇）；GAPDH：（5′-GAAGGTGAAGGTCG GAGTC/GAAGATGGTGATGGGATTTC-3＇）。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot） 將細(xì)胞在RIPA裂解緩沖液中均勻化30 min，在4℃下，12000r/min，離心半徑10 cm，離心15 min，將裂解液清除15 min，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白提取物，電轉(zhuǎn)移至PVDF。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)60 min后，在4℃下與抗SMYD3（ab187149；Abcam）、VEGF-C（ab135506；Abcam）和 VEGF-D（ab155288；Abcam）多克隆抗體孵育隔夜。用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌膜3 min，用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)抗兔免疫球蛋白抗體（SP-9001；中山生物技術(shù)）在室溫下檢測(cè)60 min。然后用PBST對(duì)膜進(jìn)行3次洗滌10 min，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察免疫復(fù)合物。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMYD3和淋巴管生成相關(guān)因子表達(dá) 胃癌MGC803細(xì)胞株中加入120 μmol/L SMYD3抑制劑BCI-121，進(jìn)一步檢測(cè)了 SMYD3、VEGF-C和VEGF-D表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGC803細(xì)胞株中SMYD3、VEGF-C和VEGF-D mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

在穩(wěn)定低表達(dá)SMYD3的細(xì)胞株（MGC803-sh-SMYD3） 檢測(cè) SMYD3、VEGF-C 和 VEGF-D mRNA和蛋白的表達(dá)，顯示MGC803-sh-SMYD3細(xì)胞株中SMYD3、VEGF-C和VEGF-D mRNA和蛋白明顯低于 MGC803 細(xì)胞株（P＜0.01）。見(jiàn)圖 1。

圖1 不同SMYD3表達(dá)細(xì)胞株中淋巴管生成因子的差異Fig.1 The expression of anti-lymphangiogenesis related factors in different SMYD3 expression cell lines

2.2 姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖及對(duì)淋巴管生成相關(guān)因子的影響 MTT檢測(cè)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)不同濃度姜黃素作用MGC803細(xì)胞株細(xì)胞增殖的差異。與未加姜黃素相比，10 μmol/L姜黃素在72 h和96 h明顯抑制細(xì)胞增殖 （P＜0.05）；30 μmol/L 姜黃素在 48、72 和96 h 明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）；而 30 μmol/L 姜黃素在 24、48、72 和 96h 明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）（圖2a）。50 μmol/L姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，因此我們選用50μmol/L姜黃素進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

50 μmol/L姜黃素處理MGC803細(xì)胞96 h后，檢測(cè)VEGF-C和VEGF-D表達(dá)變化。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示與未用姜黃素處理相比，姜黃素干預(yù)MGC803細(xì)胞中VEGF-C和VEGF-DmRNA和蛋白明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖 2b-d，差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 姜黃素對(duì)細(xì)胞增值及淋巴管生成因子的影響Fig.2 The proliferation of cells and the expression of anti-lymphangiogenesis related factors affected by curcumin

2.3 姜黃素抑制淋巴管生成相關(guān)因子可能機(jī)制探索 120 μmol/L BCI-121聯(lián)合50 μmol/L姜黃素處理MGC803細(xì)胞96 h后，檢測(cè)VEGF-C和VEGF-D表達(dá)變化，結(jié)果顯示較50 μmol/L姜黃素處理，聯(lián)合處理組MGC803細(xì)胞中VEGF-D mRNA和蛋白的表達(dá)降低（P＜0.05），而 VEGF-C 變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

50 μmol/L黃素處理MGC803細(xì)胞和MGC803-sh-SMYD3細(xì)胞96 h后，檢測(cè)VEGF-C和VEGF-D表達(dá)變化，結(jié)果顯示較MGC803-sh-SMYD3細(xì)胞中VEGF-D mRNA和蛋白的表達(dá)明顯低于MGC803細(xì)胞（P＜0.05），而 VEGF-C mRNA 和蛋白變化不明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 姜黃素干擾不同SMYD3表達(dá)細(xì)胞株中淋巴管生成因子的差異Fig.3 The expression of anti-lymphangiogenesis related factors in different SMYD3 expression cell lines affected by curcumin

3 討論

淋巴管生成在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]。淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C和VEGF-D通過(guò)結(jié)合VEGFR-3后引起下游分子Shc、Grb2磷酸化，導(dǎo)致MARK信號(hào)途徑促使淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移和存活而形成新生的淋巴管道，從而為腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移提供有利條件。淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C和VEGF-D與淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。SMYD3是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)的一種具有組蛋白甲基化功能的蛋白，功能上通過(guò)影響下游基因起到抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲、擴(kuò)散作用[10]。SMYD3在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因作用。前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)SMYD3與胃癌預(yù)后密切相關(guān)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)伴有淋巴轉(zhuǎn)移胃癌患者中SMYD3陽(yáng)性率較高，因此推測(cè)SMYD3與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。為證實(shí)SMYDE3與淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C和VEGF-D關(guān)系，在胃癌細(xì)胞株中加入SMYD3抑制劑BCI-121，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾SMYD3表達(dá)后VEGF-C和VEGF-D表達(dá)發(fā)生降低；進(jìn)一步在穩(wěn)定低表達(dá)SMYD3細(xì)胞株MGC803-sh-SMYD3中檢測(cè)VEGF-C和VEGF-D表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)MGC803-sh-SMYD3細(xì)胞中VEGF-C和VEGF-D表達(dá)低于正常細(xì)胞。結(jié)合前期研究，筆者認(rèn)為胃癌中高表達(dá)的SMYD3能夠促進(jìn)淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C和VEGF-D表達(dá)。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有多靶位，多機(jī)制，多方向，并且不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)。姜黃素作為姜黃重要組成部分，有著極其廣泛的藥理作用。近些年姜黃素發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[12]。在胃癌中，姜黃素通過(guò)抑制c-Myc/H19、PAK1/cyclin D1、11和對(duì)磷酸鳥(niǎo)苷醇-3激酶（PI3K）信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用[13]。近些年許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[14]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)姜黃素可以降低淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C和VEGF-D表達(dá)進(jìn)而影響淋巴管生成。但目前機(jī)制尚不清楚。為探索姜黃素抑制胃癌淋巴管生成相關(guān)因子是否與SMYD3相關(guān)，首先將SMYD3抑制劑BCI-121和姜黃素聯(lián)合干預(yù)胃癌細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)姜黃素干預(yù)，聯(lián)合組VEGF-D表達(dá)明顯降低。進(jìn)一步通過(guò)姜黃素干擾MGC803細(xì)胞和MGC803-sh-SMYD3，發(fā)現(xiàn)MGC803-sh-SMYD3細(xì)胞中VEGF-D表達(dá)明顯降低，而VEGF-C表達(dá)無(wú)差異。因此推測(cè)姜黃素可能通過(guò)抑制SMYD3通路進(jìn)而抑制淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-D。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)SMYD3與淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C和VEGF-D密切相關(guān)，姜黃素可能通過(guò)抑制SMYD3通路進(jìn)而抑制淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-D，進(jìn)而影響胃癌淋巴管的生成。