林小玲，方草，柯維強

（海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院藥學部，?？?570311）

慢性阻塞性肺疾病簡稱慢阻肺，是一種常見呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現為持續(xù)的氣流受阻、炎癥反應、免疫功能異常。慢阻肺發(fā)病率和病死率近年來逐漸上升，已成為人類第四大死亡原因，嚴重威脅人類生命健康[1]。由于慢阻肺病程久，易反復發(fā)作，長期使用西藥治療，不僅費用較高而且藥物毒副作用大，導致患者依從性低[2]。黨參味甘，平，歸脾肺經，可健脾益肺，補血生津，用于治療肺脾氣虛。黨參多糖是黨參主要活性成分之一，有研究表明黨參多糖可調節(jié)機體免疫力，抑制炎癥反應[3]。T細胞免疫紊亂和氣道炎癥與慢阻肺發(fā)病過程密切相關。黨參多糖對慢阻肺“肺脾氣虛證”T細胞免疫紊亂和氣道炎癥是否有治療效果目前尚未可知。黨參多糖是否通過調節(jié)核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路發(fā)揮藥效尚未見報道。因此本研究探索黨參多糖對慢阻肺肺脾氣虛證大鼠T細胞免疫紊亂和氣道炎癥的治療效果，為黨參多糖在臨床治療慢阻肺肺脾氣虛證的應用，提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料 6周齡60只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220 g購自上海靈暢生物科技有限公司[生產許可 SCXK（滬）2018-0003]；云煙購自云南云煙紅河煙草（集團）有限責任公司，焦油量10 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量12 mg；番瀉葉購自張仲景大藥房；黨參多糖購自陜西慈緣生物技術有限公司，純度≥98%；地塞米松片購自江西匯仁藥業(yè)有限公司；瑞氏-吉姆薩（Giemsa）染色液和蘇木素-伊紅（HE）染色液購自北京Solarbio公司；Trizol、細胞核蛋白與胞漿蛋白抽提試劑盒均購自購自美國賽默飛公司；反轉錄試劑盒購自美國羅氏公司；免疫沉淀試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；CD3+、CD4+、CD8+、NF-κB、核因子 κB 抑制蛋白 α（IκBα）、磷酸化核因子 κB 抑制蛋白 α（p-IκBα）單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗均購自美國Abcam公司；化學發(fā)光法（ECL）試劑盒購自美國Invitrogen公司；EMSA探針-OCT購自南京碧云天公司；引物合成委托蘇州GENEWIZ公司。

CoulterEpics XL流式細胞儀美國Beckman公司；BX60光學顯微鏡日本Olympus公司；TGL-16M高速冷凍離心機山東Biobase公司；RM2125RTS石蠟切片機德國Leica公司；VOSHIN07-II紫外交聯儀無錫沃信儀器有限公司；DYCZ-24DN迷你垂直電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 分組與干預 隨機選取50只大鼠建立慢阻肺肺脾氣虛證模型，余下10只記作對照組。共建模49 d，分別在建模第1天和第15天向大鼠氣管內滴注 1 μg/μL 的脂多糖 200 μL。建模第 2～13 天和第15～40天將大鼠置于煙熏箱中被動吸煙0.5 h，每日2次，每次間隔4 h。自建模第20天起，取番瀉葉3 g，用300 mL的沸水浸泡15 min后，置于4℃預冷制備大鼠肺脾氣虛瀉下模型，大鼠每日給予預冷的1 g/mL番瀉葉浸液，按大鼠體質量1 mL/kg灌胃，每日1次，持續(xù)30 d。觀察大鼠出現食欲減退，持續(xù)泄瀉，隨機挑出3只大鼠，通過HE染色發(fā)現大鼠氣道壁增厚等病變，表明慢阻肺肺脾氣虛證大鼠建模成功[4]，對照組大鼠正常環(huán)境下飼養(yǎng)。將成功建模的大鼠隨機分為5組：地塞米松組，黨參多糖高、中、低劑量組，模型組。地塞米松組給予1.95 mg/kg的地塞米松，黨參多糖高、中、低劑量組分別給予200、100、50mg/kg的黨參多糖，按模型組和對照組均按照大鼠體質量1 mL/kg灌胃生理鹽水。每日1次，連續(xù)治療30 d。

1.2.2 大鼠外周血 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平檢測 取大鼠尾靜脈血，加入肝素抗凝，取100 μL抗凝血，加入 5 μL CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體，4 ℃避光孵育30min，加入1mL溶血素，避光孵育10min后，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞2次，離心棄上清液，加入500 μL PBS重懸浮后，使用流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.3 大鼠支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數 打開大鼠胸腔，結扎一側肺門，分離氣管并切口，氣管插管，向氣管內注入無菌生理鹽水，反復抽注3次后，收集灌洗液至離心管中。離心半徑8 cm，1 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清液，用1 mL生理鹽水將細胞重懸浮，取20 μL細胞懸液低于細胞計數板中，風干后，使用10%福爾馬林溶液固定5 min。按照試劑盒說明書對樣品進行Giemsa染色后，進行細胞分類計數。

1.2.4 大鼠肺組織病理學觀察 取大鼠肺組織，經過10%福爾馬林溶液室溫浸泡固定過夜，進行石蠟包埋，將石蠟塊切成厚度5 μm切片，按照HE染色試劑盒說明書對切片進行HE染色。使用中性樹脂封片后在光鏡下觀察肺組織病變。

1.2.5 大鼠肺組織 NF-κB、IκBα 信使核糖核酸（mRNA）相對表達量檢測 取大鼠肺組織，加入少量液氮，研磨勻漿。向組織勻漿加入Trizol，按照提取細胞中總核糖核酸（RNA），并立即反轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA），從美國國家生物信息中心（NCBI）上查找出 NF-κB、IκBα mRNA 序列，設計出NF-κB、IκBα 上下游引物，NF-κB 上游引物：5’-TACCGTAGCCTAGACCGTAGA-3’，下游引物：5’-GTCAGCTTGACGGATATACG-3’；IκBα 上游引物：5’-CGTTAGACGTAGCAGCTGAT-3’，下游引物：5’-CTAGCGATCGTGGAACTACG-3’；β-actin 上游引物：5’-TAGTCGCTAGGGATCGGATAC-3’，下游引物：5’-CTCGGATACGGATACACTGA-3’。以 β-actin 為內參基因，根據 2-△△Ct計算出 NF-κB、IκBα mRNA 相對表達量。

1.2.6 大鼠肺組織 NF-κB和 IκBα 結合情況檢測 取大鼠肺組織研磨成漿后，使用免疫共沉淀試劑盒，按照說明書操作，檢測NF-κB結合IκBα蛋白表達水平。

1.2.7 大鼠肺組織中NF-κB與DNA結合情況檢測 取大鼠肺組織，研磨勻漿提取細胞核蛋白。設計NF-κB生物素標記探針：上游：5’-TAGGCTCT－GATGCTAGCAAGGGTAG-3’，下游：5’-TAGGCTCTGATGCTAGCAAGGGTAG-3’將生物素標記的κB寡聚核苷酸探針與核蛋白室溫避光孵育20 min，使用4%非變形丙烯酰胺凝膠進行電泳。轉膜，使用紫外交聯儀交聯1 min。使用ECL試劑盒顯色，設置Oct-1為內參，分析條帶灰度值。

1.2.8 大鼠肺組織核 NF-κB、胞漿 NF-κB、IκBα 蛋白表達水平及p-IκBα水平檢測 取大鼠肺組織，研磨勻漿，使用細胞核蛋白與胞漿蛋白抽提試劑盒分別抽提細胞核蛋白和漿蛋白。取20 μL蛋白樣品進行凝膠電泳。轉膜，使用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液室溫置于搖床上封閉2 h。加入一抗，4℃孵育過夜，使用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）清洗膜3遍后，加二抗，室溫孵育2 h，ECL顯色。以β-actin為內參，根據條帶灰度值，計算出目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 23.0對結果進行統(tǒng)計學分析，計量資料使用均數±標準差（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠外周血 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平檢測 共有48只大鼠建模成功，余下2只由于番瀉葉浸液灌胃操作不當出現死亡。

大鼠外周血 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平檢測結果顯示：治療后，模型組均低于對照組（P＜0.05），地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組均高于模型組（P＜0.05），與地塞米松組比較，黨參多糖高劑量組均升高（P＜0.05），低劑量組均降低（P＜0.05），見表 1。

表1 治療前后大鼠T淋巴細胞亞群表達結果Tab.1 Expression results of rats’T lymphocyte subsets before and after treatment

2.2 支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數 模型組均高于對照組（P＜0.05），地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），與地塞米松組比較，黨參多糖高劑量組均降低（P＜0.05），低劑量組均升高（P＜0.05）。見表 2。

表2 大鼠支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞計數結果（±s）Tab.2 Results of inflammatory cell count in rats’bronchoalveolar lavage fluid（±s）

表2 大鼠支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞計數結果（±s）Tab.2 Results of inflammatory cell count in rats’bronchoalveolar lavage fluid（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

巨噬細胞 淋巴細胞 中性粒細胞對照組 10 289.36± 61.25 18.52± 3.27 41.15± 8.33模型組 9 1 148.23±219.06*108.66±27.51*376.59±77.41*地塞米松組 9 582.56±108.38# 59.73±10.36#152.32±28.04#黨參多糖高劑量組 10 322.15± 79.91#△ 34.62± 5.48#△ 88.36±12.39#△黨參多糖中劑量組 10 527.92±84.77# 55.49±8.62#162.48±22.34#黨參多糖低劑量組 10 862.79±121.50#△ 83.48±11.69#△ 239.68±37.80#△組別 動物數

2.3 大鼠肺組織病理學觀察 與對照組相比，模型組大鼠肺組織出現嚴重炎性細胞浸潤，小支氣管平滑肌明顯增厚，有肺小泡形成并且肺泡間隔破壞；地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組支氣管平滑肌厚度輕度增加，炎性浸潤程度均減輕，肺泡間隔破壞減輕。見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理學觀察（HE，×200）Fig.1 Pathological observation of rats’lung tissue(HE，×200)

2.4 肺組織NF-κB、IκBα mRNA相對表達量 模型組均高于對照組（P＜0.05），地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），與地塞米松組相比，黨參多糖高劑量組均降低（P＜0.05）、低劑量組均升高（P＜0.05），IκBα mRNA 相對表達量模型組均低于對照組（P＜0.05），地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組均高于模型組（P＜0.05），與地塞米松組比較，黨參多糖高劑量組均升高（P＜0.05），低劑量組均降低（P＜0.05）。見表3。

表3 大鼠肺組織 NF-κB、IκBα mRNA 相對表達量（±s）Tab.3 Relative expression of NF-κB and IκBα mRNA in rats’lung tissue（±s）

表3 大鼠肺組織 NF-κB、IκBα mRNA 相對表達量（±s）Tab.3 Relative expression of NF-κB and IκBα mRNA in rats’lung tissue（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與地塞米松組比較，cP＜0.05。

組別 動物數 NF-κB IκBα對照組 10 0.42±0.08 0.85±0.08模型組 9 1.33±0.16a 0.22±0.09a地塞米松組 9 0.87±0.07b 0.55±0.14b黨參多糖高劑量組 10 0.65±0.12bc 0.74±0.17bc黨參多糖中劑量組 10 0.89±0.15b 0.59±0.09b黨參多糖低劑量組 10 1.12±0.14bc 0.34±0.06bc

2.5 大鼠肺組織NF-κB和IκBα結合情況檢測 免疫共沉淀結果顯示，IκBα與NF-κB可結合，且模型組IκBα和NF-κB結合最少，黨參多糖低劑量組稍多，地塞米松組和中劑量組較多，黨參多糖高劑量組更多，對照組最多。見圖2。

圖2 免疫共沉淀檢測大鼠肺組織NF-κB和IκBα結合情況Fig.2 Co-immunoprecipitation to detect the binding of NF-κB and IκBα in rats’lung tissues

2.6 大鼠肺組織中NF-κB與DNA結合情況檢測 EMSA結果顯示，NF-κB灰度值模型組均高于對照組（P＜0.05），地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），與地塞米松組相比，黨參多糖高劑量組均降低（P＜0.05）、低劑量組均升高（P＜0.05）。見圖 3，表 4。

2.7 大鼠肺組織核 NF-κB、胞漿 NF-κB、IκBα 蛋白表達水平及p-IκBα水平 結果顯示模型組均高于對照組（P＜0.05），地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），與地塞米松組比較，黨參多糖高劑量組均降低（P＜0.05），低劑量組均升高（P＜0.05）；胞漿NF-κB 和 IκBα 蛋白表達水平：模型組均低于對照組（P＜0.05），地塞米松組和黨參多糖高、中、低劑量組均高于模型組（P＜0.05），與地塞米松組比較，黨參多糖高劑量組均升高（P＜0.05），低劑量組均降低（P＜0.05）。見表4，圖4。

圖4 大鼠肺組織核NF-κB、胞漿NF-κB、IκBα蛋白表達水平及 p-IκBα水平（WB）Fig.4 Rats’lung tissue nuclear NF-κB，cytoplasmic NF-κB，IκBα protein expression levels and p-IκBα levels(WB)

表4 各組大鼠肺組織NF-κB相對灰度值（±s）Tab.4 Relative gray value of NF-κB in lung tissue of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠肺組織NF-κB相對灰度值（±s）Tab.4 Relative gray value of NF-κB in lung tissue of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與地塞米松組比較，cP＜0.05。

組別 動物數 NF-κB對照組 10 0.33±0.04模型組 9 12.76±1.35a地塞米松組 9 4.33±0.77b黨參多糖高劑量組 10 1.02±0.14bc黨參多糖中劑量組 10 3.79±0.23b黨參多糖低劑量組 10 7.37±1.14bc

表4 大鼠大鼠肺組織核NF-κB、胞漿NF-κB、IκBα蛋白相對表達水平及 p-IκBα 水平（±s）Tab.4 The relative expression levels of nuclear NF-κB，cytoplasmic NF-κB，and IκBα protein in rat’lung tissue and the level of p-IκBα（±s）

表4 大鼠大鼠肺組織核NF-κB、胞漿NF-κB、IκBα蛋白相對表達水平及 p-IκBα 水平（±s）Tab.4 The relative expression levels of nuclear NF-κB，cytoplasmic NF-κB，and IκBα protein in rat’lung tissue and the level of p-IκBα（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 核NF-κB 胞漿NF-κB IκBα p-IκBα對照組 10 0.26±0.04 0.56±0.12 0.85±0.06 0.13±0.03模型組 9 1.42±0.18*0.12±0.02*0.35±0.10*0.85±0.12*地塞米松組 9 0.65±0.12#0.36±0.05#0.52±0.10#0.54±0.10#黨參多糖高劑量組 10 0.39±0.06#△ 0.44±0.08#△ 0.71±0.19#△ 0.32±0.06#△黨參多糖中劑量組 10 0.60±0.11#0.35±0.07#0.51±0.08#0.57±0.04#黨參多糖低劑量組 10 0.91±0.18#△ 0.17±0.06#△ 0.44±0.05#△ 0.69±0.14#△

3 討論

慢阻肺在中醫(yī)歸屬于“咳嗽”“喘證”“肺脹”“痰飲”，是由于外邪侵襲犯肺，致內生痰濁，導致肺氣阻滯，引起本虛標實。脾虛引起氣血乏源，進一步加重肺虛，循環(huán)反復，導致肺脾兩虛[5]。中藥黨參為草本植物黨參的根部，是補益類傳統(tǒng)藥材，具有補中益氣、健脾益肺的功效，用于治療脾胃虛弱、肺虛咳喘、氣微兩虧等[6]。有研究表明，黨參多糖可抑制慢阻肺小鼠肺泡巨噬細胞功能障礙[7]。因此本研究使用探索黨參多糖對慢阻肺大鼠T細胞免疫胞免疫和氣道炎癥的作用具有可行性。

有研究表明T淋巴細胞亞群失衡是引起慢阻肺發(fā)病的機制之一[8]。CD3+由成熟的T淋巴細胞表達，是成熟T淋巴細胞表面標志物，CD3+表達降低，表示外周血中成熟的T淋巴細胞數量下降[9]。CD4+是輔助淋巴細胞表面標志物，可調控或協助其他類型免疫細胞的激活，對體液免疫和細胞免疫均具有促進作用[10]。CD8+是細胞毒T淋巴細胞表面標志物，可特異性殺傷受感染細胞，免疫學上使用CD4+/CD8+表示機體免疫防御狀態(tài)，CD4+/CD8+比值降低表示機體免疫功能降低[11]。本研究結果顯示，慢阻肺模型大鼠肺組織灌洗液中巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒含量顯著高于對照組，而經過黨參多糖治療后，巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒含量均出現降低，表明黨參多糖可抑制慢阻肺大鼠氣道炎癥反應。

NF-κB是機體重要轉錄因子，可調節(jié)免疫反應、炎癥反應過程中的眾多信號通路[12]。NF-κB在正常生理狀態(tài)下與IκB結合，存在細胞漿中，導致NF-κB失活。當機體受到外界刺激后，NF-κB信號被激活，IκB 磷酸化導致 NF-κB 與 IκB 分離，游離的 NF-κB進入細胞核與多種下游靶基因結合，誘導多種促炎因子釋放，引起炎癥反應[13]。本研究結果顯示，慢阻肺大鼠肺組織NF-κB與IκBα結合水平較低，而NF-κB 與 DNA 結合水平較高，NF-κB mRNA、核NF-κB 蛋白及 p-IκBα 水平均升高，IκBα mRNA 和蛋白水平、胞漿NF-κB蛋白水平均降低，而經過黨參多糖治療后，NF-κB 與 IκBα 結合水平升高，NF-κB與 DNA 結合水平降低，NF-κB mRNA、核 NF-κB 蛋白及 p-IκBα 水平均降低，IκBα mRNA 和蛋白水平、胞漿NF-κB蛋白水平均升高，由此可推測，黨參多糖可減輕慢阻肺“肺脾氣虛證”大鼠T細胞免疫紊亂和氣道炎癥與抑制NF-κB信號通路激活，抑制NF-κB核位移有關。

綜上所述，黨參多糖可抑制慢阻肺“肺脾氣虛證”大鼠T細胞免疫紊亂，減輕氣道炎癥反應和肺組織病變，推測可能與抑制NF-κB信號傳導，下調NF-κBmRNA、抑制NF-κB 核位移及抑制 p-IκBα 水平，上調 IκBα mRNA、蛋白表達水平及胞漿 NF-κB蛋白表達水平有關。本研究僅從動物實驗的層面研究黨參多糖對慢阻肺肺脾氣虛患者T細胞免疫紊亂和氣道炎癥的治療作用，黨參多糖治療慢阻肺肺脾氣虛患者的臨床療效尚未可知，仍需進一步研究。