肖揚(yáng) ，劉瑩 ，徐亞潔 ，李國政 ，耿彤 ，徐津鵬 ，王怡

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250；2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，天津 300457；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

通脈養(yǎng)心丸源于漢代醫(yī)圣張仲景《傷寒論》的名方“炙甘草湯”，經(jīng)天津名醫(yī)董曉初精心鉆研，加減化裁而來。通脈養(yǎng)心丸在臨床上對氣陰兩虛型及氣陰兩虛合并血瘀型冠心病均具有較好的改善作用[1-2]。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，在細(xì)胞水平通脈養(yǎng)心丸對缺氧損傷的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，其可能的機(jī)制為減輕心肌細(xì)胞鈣超載[3]、抗炎、抗氧化[4]等。整體實(shí)驗(yàn)方面，通脈養(yǎng)心丸能夠改善腎上腺素所致的大鼠心律失常[5]。從整合藥理學(xué)的角度分析其治療冠心病心絞痛及心律不齊的分子機(jī)制，研究結(jié)果表明通脈養(yǎng)心丸能通過線粒體途徑、能量代謝等多條途徑發(fā)揮藥效的[6]。動脈粥樣硬化（AS）是冠心病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，基于通脈養(yǎng)心丸顯著的臨床療效及上述基礎(chǔ)研究結(jié)果，推測其可能對AS具有一定的改善作用。本實(shí)驗(yàn)將以此為研究切入點(diǎn)，考察通脈養(yǎng)心丸對載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠斑塊形成的影響及可能的作用機(jī)制。

AS發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，涉及多個(gè)病理環(huán)節(jié)[7]。目前對于AS發(fā)病機(jī)制的各種學(xué)說各有側(cè)重，都不十分完善，因此預(yù)測藥效發(fā)生機(jī)制必然存在較大困難?？紤]到上述情況，本實(shí)驗(yàn)采用Affymetrix Mouse Genome對小鼠動脈組織基因譜進(jìn)行檢測，并進(jìn)行深入數(shù)據(jù)分析，對產(chǎn)生藥效的可能機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）及酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）法對有代表性的作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，在明確藥效的基礎(chǔ)上對通脈養(yǎng)心丸抗AS作用機(jī)制進(jìn)行探索，為拓展通脈養(yǎng)心丸的臨床使用范圍提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為中藥復(fù)方機(jī)制研究提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ApoE-/-小鼠，雄性，4周齡，常規(guī)條件（小鼠維持飼料，自由飲水，溫度24～26℃，相對濕度40%～60%）飼養(yǎng)6周后開始藥物干預(yù)；給藥同時(shí)開始采用高脂飼料（基料78.8%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇 1.0%、豬膽鹽 0.2%）飼養(yǎng)。C57BL/6J小鼠，雄性，4周齡，始終保持常規(guī)條件飼養(yǎng)。以上實(shí)驗(yàn)動物購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心，許可證編號：SCXK（京）2011-0012。

1.2 分組及給藥方法 將72只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組、通脈養(yǎng)心丸2.0 g/kg組、通脈養(yǎng)心丸 1.0 g/kg 組、通脈養(yǎng)心丸 0.5 g/kg 組，6 只C57BL/6J小鼠為空白對照組。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 通脈養(yǎng)心丸（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠）；油紅O（Chroma進(jìn)口分裝）；總膽固醇（TC）測定試劑盒、三酰甘油（TG）測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script TMRT Reagent Kit（TaKaRa Biotechnology）；SYBYPremixExTaqTM（TaKaRa Biotechnology）；磷酸化核轉(zhuǎn)移因子（p-NF-κB）ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（R & D Systems）；白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒，白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；引物序列由http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/獲得，由金唯智生物科技公司合成。微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司XW-80A型）；微量振蕩器（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，ZW-A型）；組織包埋機(jī)（日本櫻花VAP15JR組織包埋機(jī)）；切片機(jī)（日本櫻花CRM-60推拉式組織切片機(jī)）；正置顯微鏡（日本Olympus公司，CH30型）；正置顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本Olympus公司，BX41型）；圖像分析軟件（美國Image-Pro Plus Version 6.0（IPP））；Allegra-64RCentrifuge 低溫高速離心機(jī)（美國BECKMAN）；DU-530紫外分光光度計(jì)（美國 DNA/Protein Analyzer，BECKMAN）；ABI?7300實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)（美國AppliedBiosystems）；掃描儀（Scanner 3000 Hybridization，Affymetrix）；雜交爐（Hybridization Oven 640，Affymetrix）等。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠血脂及斑塊形成的影響 采用生化法測定實(shí)驗(yàn)動物血清中TC及TG的水平。每組隨機(jī)取6只小鼠，將主動脈至髂動脈分叉處的整條動脈，進(jìn)行油紅O染色。采用Image J 6.0軟件將紅染部位標(biāo)記，并計(jì)算斑塊面積占總面積的比值。每組取6只小鼠分別取主動脈弓、胸主動脈、腹主動脈，用10%甲醛溶液固定，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法，觀察斑塊（橫切）情況，并采用Image J 6.0軟件標(biāo)記并分別計(jì)算主動脈弓、胸主動脈及腹主動脈斑塊面積與管腔面積的比值。

1.4.2 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠動脈基因表達(dá)的影響 按照試劑盒說明書提取小鼠動脈組織中的總RNA，樣品總RNA利用NanoDrop ND-2100（Thermo Scientific）定量并經(jīng) Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測 RNA 完整性。RNA質(zhì)檢合格后，樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。洗脫和染色后利用Affymetrix Scanner 3000（Affymetrix）掃描得到原始圖像。原始圖像采用Affymetrix GeneChip Command Console軟件（version4.0，Affymetrix）處理提取原始數(shù)據(jù)。接著利用 Genespring軟件（version 12.5；Agilent Technologies）進(jìn)行MAS5標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，將每組差異篩選中至少有1組樣本75%標(biāo)記為P的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4.3 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠動脈組織中PPARα mRNA表達(dá)的影響 根據(jù)試劑盒說明，提取小鼠動脈組織中的mRNA，測定mRNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明冰上操作，合成cDNA于-80℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析軟件測定PPARαmRNA的表達(dá)。反應(yīng)以GAPDH作為內(nèi)參。

1.4.4 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠血漿中p-NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平的影響 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測步驟進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異基因利用t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。將標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，Ingenuity Canonical通路分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 通脈養(yǎng)心丸對小鼠血脂及斑塊形成的影響 模型組小鼠血清中TC、TG水平顯著升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），通脈養(yǎng)心丸各劑量組 TC 水平顯著低于模型組（P＜0.01）；通脈養(yǎng)心丸高劑量組TG水平顯著低于模型組（P＜0.01），中、低劑量組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；經(jīng)油紅O染色，對照組小鼠動脈無明顯紅染，模型組小鼠動脈壁有大面積紅染，說明有大面積斑塊形成，并且在主動脈弓分支部位較為集中。低劑量組斑塊面積與血管壁總面積的比值與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；高、中劑量組斑塊面積與血管壁總面積的比值明顯小于模型組（P＜0.01），說明高、中劑量對斑塊的形成具有一定的抑制作用；經(jīng)HE染色，鏡下觀察，模型組小鼠動脈管壁內(nèi)膜大面積粥樣斑塊形成，管腔變窄，局部血管內(nèi)膜大量炎性細(xì)胞浸潤；高劑量組可見局灶性斑塊形成，血管內(nèi)皮增厚，表面可見少量炎細(xì)胞浸潤；中劑量組管壁內(nèi)膜粥樣斑塊形成，管腔變窄，內(nèi)皮增厚，局部血管內(nèi)膜大量灶性炎細(xì)胞浸潤。低劑量組管壁內(nèi)膜大面積粥樣斑塊形成，內(nèi)皮增厚，管腔變窄，局部血管內(nèi)膜大量灶性炎細(xì)胞浸潤。采用Image J 6.0軟件分別計(jì)算主動脈弓部、胸主動脈部和腹主動脈斑塊面積與管腔面積比值發(fā)現(xiàn)，高劑量對主動脈弓及胸主動脈狹窄具有一定的改善作用（P＜0.05），中、低劑量組對以上3個(gè)部分動脈管腔狹窄具有改善趨勢，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。具體結(jié)果見表1、2 及圖 1、2。

圖2 通脈養(yǎng)心丸對胸主動脈弓部斑塊的影響（HE，×400）Fig.2 Effect of Tongmai Yangxin Pill on plaque of thoracic aortic arch(HE，×400)

表1 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠血清TC和TG的影響（±s）Tab.1 Effect of Tongmai Yangxin Pill on TC and TG in ApoE-/-mice（±s）

表1 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠血清TC和TG的影響（±s）Tab.1 Effect of Tongmai Yangxin Pill on TC and TG in ApoE-/-mice（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) TC（mmol/L） TG（mmol/L）空白對照組 6 1.47±0.31 1.19±0.11模型組 6 17.57±0.90## 2.07±0.14##通脈養(yǎng)心丸 2.0 g/kg 組 6 8.57±1.15** 1.41±0.05**通脈養(yǎng)心丸 1.0 g/kg 組 6 13.78±1.04** 1.97±0.16通脈養(yǎng)心丸 0.5 g/kg 組 6 16.13±1.10* 2.15±0.22

表2 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠斑塊形成的影響（±s）Tab.2 Effect of Tongmai Yangxin Pill on plaque formation in ApoE-/-mice（±s）

表2 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠斑塊形成的影響（±s）Tab.2 Effect of Tongmai Yangxin Pill on plaque formation in ApoE-/-mice（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，與模型組比較，**P＜0.01；斑塊總面積以斑塊面積/血管壁總面積表示，主動脈弓、胸主動脈、腹主動脈數(shù)據(jù)以斑塊面積/管腔面積表示。

腹主動脈（橫切）空白對照組 6 0.00 0.00 0.00 0.00模型組 6 0.65±0.12 1.19±0.36 0.66±0.19 0.55±0.17通脈養(yǎng)心丸 2.0 g/kg組 6 0.43±0.13**0.79±0.24*0.44±0.13*0.45±0.12通脈養(yǎng)心丸 1.0 g/kg組 6 0.44±0.15**1.10±0.39 0.50±0.18 0.53±0.14通脈養(yǎng)心丸 0.5 g/kg組 6 0.56±0.08 1.18±0.34 0.72±0.17 0.50±0.20組別 動物數(shù)斑塊總面積（縱剖）主動脈弓（橫切）胸主動脈（橫切）

2.2 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠動脈組織基因表達(dá)的影響

2.2.1 差異基因分析 使用Welch t test檢驗(yàn)，以P＜0.05，abs_fc＞2，bad flag＜5 為篩選條件，模型組與空白對照組比較，共篩選出253個(gè)差異探針。其中上調(diào)基因157個(gè)探針（對應(yīng)128個(gè)基因），下調(diào)96個(gè)探針（對應(yīng)79個(gè)基因），其中下調(diào)最為顯著的是ApoE基因，與動物模型相符。在相同條件下，通脈養(yǎng)心丸2.0 g/kg組與模型組比較，共篩選出100條差異基因，其中74個(gè)探針（對應(yīng)60個(gè)基因）上調(diào)，49個(gè)探針（對應(yīng)40個(gè)基因）下調(diào)。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，將進(jìn)行聚類分析和Ingenuity Canonical通路分析。

2.2.2 聚類分析 由于本研究中空白對照組與模型組采用的實(shí)驗(yàn)動物存在品系上的差異，因此對于差異基因的聚類分析采用兩組間獨(dú)立比較，即模型組與空白對照組比較，給藥組與模型組比較；將差異基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3。

圖3 差異基因聚類分析Fig.3 Cluster analysis of differential genes

2.2.3 Ingenuity Canonical通路分析 將標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)導(dǎo)入https：//apps.ingenuity.com/進(jìn)行相關(guān)通路分析，模型組與空白對照比較發(fā)生變化的通路有359條，輸入atherosclerosis作為限定條件，篩選出動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制相關(guān)的通路主要有10條。相同條件下，通脈養(yǎng)心丸2.0 g/kg組與模型組比較，相關(guān)通路主要有5條，見表3。通脈養(yǎng)心丸可能通過影響Atherosclerosis Signaling中的 PPARα/RXRα Activation、Inhibition of Matrix Metalloproteases、PDGF Signaling發(fā)揮藥理作用。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和PPARα活化在斑塊形成過程中的重要作用，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將對PPARα mRNA表達(dá)及下游的部分炎癥因子表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。

表3 Ingenuity Canonical分析Tab.3 Ingenuity canonical analysis %

2.3 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠動脈組織中PPARα mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠PPARα mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01），通脈養(yǎng)心丸高劑量組能顯著上調(diào)小鼠動脈組織中PPARα mRNA表達(dá)。引物序列見表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

表4 RT-PCR引物序列Tab.4 Primer sequence of RT-PCR

圖4 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠PPARα mRNA表達(dá)的影響（±s）Fig.4 Effect of Tongmai Yangxin Pill on PPARα mRNA expression in ApoE-/-mice（±s）

2.4 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠血漿中p-NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平的影響 采用ELISA法對小鼠血清中部分炎性因子水平進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠血清中p-NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6均顯著升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。高劑量組小鼠上述分子均顯著降低（P＜0.01）；中劑量對TNF-α、IL-1β及IL-6具有顯著降低作用（P＜0.01），對 p-NF-κB 無明顯影響（P＞0.05）；低劑量能顯著降低 IL-1β 及 IL-6 水平（P＜0.05），對 p-NF-κB 和 TNF-α 無明顯影響（P＞0.05）。見表5。

表5 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠血漿炎性因子水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Tongmai Yangxin Pill on plasma inflammatory factors in ApoE-/-mice（±s） （ng/mL）

表5 通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠血漿炎性因子水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Tongmai Yangxin Pill on plasma inflammatory factors in ApoE-/-mice（±s） （ng/mL）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.05。

組別 動物數(shù) p-NF-κB TNF-α IL-6 IL-1β空白對照組 6 144.78±19.90 0.067±0.002 4 164.30±208.35 3 827.53± 213.00模型組 6 330.90±26.95## 0.084±0.005# 9 767.04±413.05## 10 109.38± 624.59##通脈養(yǎng)心丸 2.0 g/kg 組 6 155.84±23.53** 0.073±0.008** 4 556.21±199.67** 4 765.27± 295.23**通脈養(yǎng)心丸 1.0 g/kg 組 6 178.36±25.60 0.084±0.009** 6 310.03±1 121.36** 7 285.95±1 079.31**通脈養(yǎng)心丸 0.5 g/kg 組 6 282.97±43.70 0.087±0.007 6 972.47±403.73* 7 879.39±1 120.36*

3 討論

AS是一種較為復(fù)雜慢性炎性疾病[8]，是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，受基因、飲食、環(huán)境等多因素的影響，能夠累積到多器官，多靶點(diǎn)，與高血壓病、糖尿病、肥胖等多種疾病相互影響，互為因果。目前對于AS的研究已經(jīng)進(jìn)入了系統(tǒng)生物學(xué)研究的層面[9-10]，更加注重分子間的相互作用對疾病進(jìn)程的影響，更加注重整體觀念。本研究利用高通量、高集成的基因芯片技術(shù)，試圖闡明通脈養(yǎng)心丸的藥效作用機(jī)制，同時(shí)考慮了疾病與藥物多個(gè)變量對生物體的影響，與單一通路探索實(shí)驗(yàn)比較，更具有實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)在明確所有差異基因的基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，預(yù)測出通脈養(yǎng)心丸產(chǎn)生藥效的關(guān)鍵信號通路為 PPARα/RXRα Activation、Inhibition of Matrix Metalloproteases、PDGF Signaling 等，這對進(jìn)一步印證其作用機(jī)制極為重要。本實(shí)驗(yàn)也為中藥復(fù)方機(jī)制研究提供了新的思路。

Ingenuity Canonical通路分析結(jié)果顯示，PPARα活化可能是通脈養(yǎng)心丸產(chǎn)生藥效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并且對PPARα/RXRα通路上表達(dá)發(fā)生變化的分子數(shù)目最多，因此選擇了對PPARα mRNA表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠PPARα mRNA表達(dá)顯著下降，而通脈養(yǎng)心丸能夠顯著上調(diào)其表達(dá)，說明通脈養(yǎng)心丸對PPARα具有顯著的活化作用。有研究表明PPARα能夠通過與其配體結(jié)合調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而對脂代謝、糖代謝、炎癥反應(yīng)等過程產(chǎn)生影響[11]。同時(shí)還能夠通過抑制NF-кB亞基p65的遷移，降低炎癥因子的表達(dá)[12]。上述研究結(jié)果說明PPARα活化能夠直接和間接抑制炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)對血管內(nèi)皮的損傷，抑制AS斑塊的形成。因此，本研究對小鼠血清中的部分炎癥因子水平進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，通脈養(yǎng)心丸對于p-NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均具有較為明顯的抑制作用。綜上所述，通脈養(yǎng)心丸對ApoE-/-小鼠動脈斑塊的形成具有顯著的抑制作用，活化PPARα進(jìn)而抑制下游炎癥因子的表達(dá)是其發(fā)揮藥物療效的途徑之一。