楊吉鵬，邱翔，王同聚，李琛，楊建凱，李京臣，焦保華

0 引言

膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）是人腦膠質(zhì)瘤中惡性程度最高一個亞型（WHO Ⅳ級）。盡管近幾年針對GBM的化療與放療已取得巨大進展，但GBM患者5年生存率仍不超過5%[1]。研究發(fā)現(xiàn)已有多種分子機制、信號通路與表觀遺傳學(xué)變化等共同參與了GBM的發(fā)生和發(fā)展，過程極其復(fù)雜。目前有關(guān)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）、小RNA（microRNA）在膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用已成為研究熱點[2]。LncRNA SNHG5已被證實在GBM中呈高表達并促進GBM細胞增殖、侵襲與抗凋亡進程[3]。本課題組查詢LncBase等生物信息網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，SNHG5與miR-421具有潛在的結(jié)合位點，故本研究將探討SNHG5與miR-421在GBM中的相互作用關(guān)系，進一步研究SNHG5在GBM中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科2018年1月—2020年5月住院的GBM患者標本31例，其中男性20例，女性11例，年齡42～71（53.43±4.42）歲。每例腫瘤標本均由該院兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師核實并診斷為GBM（根據(jù)WHO 2007年標準），術(shù)中對上述患者分別留取少許腫瘤組織標本進行后續(xù)實驗，取32例重型顱腦創(chuàng)傷的患者術(shù)中失活腦組織作為對照。本研究經(jīng)該院倫理委員會審核后批準同意。

1.2 試劑與儀器

國產(chǎn)Hyclone DMEM/High-Glucose培養(yǎng)基購自中國Gibco公司，10%特級胎牛血清及雙抗購自美國Gibco公司，BAX、Bcl-2、CyclinD1、p21及GAPDH抗體購自英國Abcam公司，miR-421及U6引物由北京Invitrogen公司合成，干擾SNHG5表達的慢病毒購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，SNHG5野生型和突變型雙熒光素酶報告載體、SNHG5干擾劑（si-SNHG5）與SNHG5過表達質(zhì)粒（pcDNA-SNHG5）均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，裸鼠購自南京君科生物工程有限責(zé)任公司，Dual-Luciferase? Reporter試劑盒購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司，Applied Biosystems 9700實時熒光定量PCR儀購自美國Life Technologies公司，BioTek Synergy HT多功能酶標儀購自美國伯騰公司，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂Bio-Rad公司，DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠，Olympus光學(xué)顯微鏡和倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，SW-CJ-IFD凈化工作臺購自蘇州蘇凈集團安泰空氣技術(shù)公司，Thermo Forma 3111二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，AP250D-0電子天平購自美國Ohaus公司，MLS-3020CH高壓蒸汽滅菌器購自日本SANYO公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

取人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87（中國科學(xué)院），于10%的FBS、100 u/ml青霉素、100 pg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度下孵育，倒置顯微鏡下觀察U87細胞生長情況，每兩日更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)染。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

構(gòu)建并合成分別干擾SNHG5、miR-421表達的慢病毒及對照空載慢病毒，當(dāng)U87細胞融合率至40%左右時計算病毒用量，MOI值取4，計算出所需慢病毒的體積并將其與溴化己二甲銨及轉(zhuǎn)染增效試劑轉(zhuǎn)染至U87細胞系中，轉(zhuǎn)染后16 h更換完全培養(yǎng)基，72 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光并收集細胞進行PCR檢測驗證轉(zhuǎn)染效果。建立SNHG5穩(wěn)定低表達的U87細胞系sh-SNHG5及對照細胞系shcontrol，用實時熒光定量PCR檢測兩組miR-421的表達，驗證miR-421的表達變化。

用上述方法將干擾miR-421表達的慢病毒轉(zhuǎn)染至SNHG5低表達的U87細胞系sh-SNHG5中，建立SHNG5與miR-421均低表達的細胞系sh-SNHG5+anti-miR-421與對照細胞系sh-SNHG5+anti-control進行動物實驗，檢測兩組裸鼠成瘤體積與重量的差異。

收集對數(shù)生長期的U87細胞，以每孔2×105個細胞接種于6孔板中，待細胞長滿瓶底時進行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine 2000將pcDNA-SNHG5、pcDNA-control、si-SNHG5+miR-421-inhibitor與si-SNHG5+control-inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)入U87細胞，建立pcDNA-SNHG5細胞系、pcDNA-control細胞系、si-SNHG5+miR-421-inhibitor細胞系與si-SNHG5+control-inhibitor細胞系，48 h后收集各組細胞進行PCR驗證效果。

1.5 實時熒光定量PCR實驗

收集GBM腫瘤組織與正常腦組織標本及各組轉(zhuǎn)染后的U87細胞，根據(jù)試劑盒說明書提取組織與細胞總RNA，用紫外分光光度計測定其吸光度值，當(dāng)OD260/OD280的值在1.6～2.0之間時，說明RNA質(zhì)量最好，計算RNA濃度，將上述總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)試劑盒說明書進行PCR進行擴增，檢測組織標本與各組U87細胞中的SNHG5與miR-421的相對表達水平。GAPDH與U6作為內(nèi)參照。引物設(shè)計如下：SNHG5上游引物：5’-CGCTTGGTTAAAACCTGACACT-3’，下游引物：5’-CCAAGACAATCTGGCCTCTATC-3’；miR-421上游引物：5’-GCGCGGATCAACAGACATTAATT-3’，下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH上游引物：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’，下游引物：5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。每組實驗重復(fù)3次。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

通過檢索生物信息網(wǎng)站LncBase Predicted V2.0，本課題組預(yù)測SNHG5可能與miR-421靶向結(jié)合，構(gòu)建插入熒光素酶的野生型與突變型SNHG5質(zhì)粒，并將上述兩種質(zhì)粒分別與miR-421過表達的質(zhì)粒及空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入U87細胞中，建立WTSNHG5+miR-421、WT-SNHG5+miR-control、MUT-SNHG5+miR-421和MUT-SNHG5+miR-control四組細胞系，于轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞，根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書步驟先后測定出螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性即為報告基因活性。

1.7 CCK-8細胞增殖實驗

將轉(zhuǎn)染后的實驗組（si-SNHG5+miR-421-inhibitor）及對照組（si-SNHG5+control-inhibitor）細胞種植于96孔板上，每組分別取5個時間點（24、48、72、96和120 h）進行檢測，每組各時間點分別取4個復(fù)孔，每孔的細胞密度為4×103個細胞/孔，培養(yǎng)基100 μl，置于培養(yǎng)箱孵育，分別于24、48、72、96和120 h，加入10 μl的CCK-8試劑，加試劑前更換培養(yǎng)基?？瞻卓變?nèi)添加100 μl培養(yǎng)基與10 μl的CCK-8試劑，將上述細胞孵育4 h后用酶標儀測定560 nm的吸光度值。

1.8 Transwell實驗

將si-SNHG5+miR-421-inhibitor組與si-SNHG5+control-inhibitor組細胞種植于24孔板的小室上，細胞密度為1×105個細胞/孔，加入100 μl無血清的培養(yǎng)基孵育，小室底部鋪纖維連接蛋白膜，小室外加600 μl含30%血清的培養(yǎng)基，孵育24 h后取出，輕輕擦去小室面膜上的細胞，在小室膜的外表面用甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min后清水洗滌3遍，置于顯微鏡下放大100倍并隨機選取6個視野，計數(shù)每個視野內(nèi)的細胞數(shù)量，計算細胞數(shù)量的平均值并拍照。

1.9 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

按試劑盒說明書預(yù)先配置工作液，將sh-SNHG5組細胞與sh-control組細胞、si-SNHG5+miR-421-inhibitor組細胞與si-SNHG5+control-inhibitor組細胞經(jīng)胰酶消化后取預(yù)冷過的PBS緩慢沖洗兩遍，離心后棄上清液，取事先配置好的工作液緩慢沖懸細胞，再分別依次添加10 μl的7-AAD及5 μl的Annexin V試劑，于室溫避光放置15 min后上流式細胞儀測細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.10 Western blot實驗

于冰浴中充分研磨細胞同時加入適量的RIPA蛋白裂解液，取蛋白濃度測定試劑盒（BCA,Pierce）測量樣品蛋白濃度，根據(jù)樣品體積與上樣緩沖液體積的比值為4∶1計算需要加入的5×上樣緩沖液的體積，取封口膜封緊管口，煮沸5 min，分裝放置于-20℃保存。在預(yù)先制好的12%的聚丙烯酰胺凝膠板的每孔內(nèi)加入100 μg的蛋白進行電泳，轉(zhuǎn)膜時按照海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿的順序放好，約1.5 h后取5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液封閉1 h，分別加入兔抗人BAX、Bcl-2、CyclinD1與p21多克隆抗體（抗體稀釋濃度分別是1∶500、1∶2000、1∶5000與1∶1000），密封后置于4℃冰箱過夜。次日添加二抗，避光，室溫孵育2 h。用1×TBST清洗3次，每次15 min，于雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描使條帶顯影，最后用利Image-Pro Plus 6軟件進行灰度定量分析。檢測Anti-SNHG5+si-control與Anti-SNHG5+si-miR-421組間CyclinD1、p21、BAX與Bcl-2蛋白表達水平的差異。每組實驗重復(fù)3次。取GAPDH作為內(nèi)參照，計算目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值。

1.11 裸鼠成瘤實驗

選購20只4周齡雌性裸鼠，分為實驗組與對照組（各10只），將sh-SNHG5+anti-miR-421細胞與對照細胞系sh-SNHG5+anti-control分別注射于兩組裸鼠側(cè)背部皮下，每只注射5×106個細胞，于無菌飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，每周測量一次成瘤的長徑及短徑，飼養(yǎng)5周后宰殺裸鼠并取出瘤體，稱重拍照。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)母細胞瘤中SNHG5和miR-421的表達情況

與正常腦組織標本相比，GBM組織中SNHG5的表達顯著升高，而miR-421表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 SNHG5(A)和miR-421(B)在正常腦組織標本與GBM組織中的表達Figure 1 Expression of SNHG5(A) and miR-421(B) in normal brain sample and GBM sample

2.2 降低SNHG5的表達可抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、侵襲，促進細胞凋亡

CCK-8實驗結(jié)果顯示：sh-SNHG5組和shcontrol組細胞450 nm吸光度值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。第5天sh-SNHG5組U87細胞增殖能力比sh-control組顯著下降（t=3.444,P=0.0137）。Transwell實驗結(jié)果表明：sh-SNHG5組細胞侵襲力（48.6±9.2個）明顯低于sh-control組（142±8.7個）（t=7.361,P=0.0018），見圖3。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：sh-SNHG5組的細胞凋亡比例（（16.21±0.86）%）顯著高于sh-control組（（7.32±0.72）%）（t=7.91,P=0.0014），見圖4。以上實驗結(jié)果提示SNHG5低表達可有效抑制GBM細胞增殖、侵襲，促進細胞的凋亡。

圖2 抑制SNHG5表達后sh-SNHG5組與sh-control組細胞增殖能力的比較Figure 2 Comparison of cell proliferation abilities between sh-SNHG5 group and sh-control group after decreasing SNHG5 expression

圖3 抑制SNHG5表達后sh-SNHG5組與sh-control組細胞侵襲力的比較Figure 3 Comparison of cell invasive abilities between sh-SNHG5 group and sh-control group after decreasing SNHG5 expression

圖4 抑制SNHG5表達后sh-SNHG5組與sh-control組細胞凋亡的比較Figure 4 Comparison of cell apoptosis between sh-SNHG5 group and sh-control group after decreasing SNHG5 expression

2.3 SNHG5可靶向并負向調(diào)控miR-421的表達

實時熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GBM組織中SNHG5與miR-421表達呈負相關(guān)（r2=0.5274,P=0.0000），見圖5A。與pcDNA-control組（0.77±0.09）相比，pcDNA-SNHG5組細胞中miR-421表達（0.24±0.08）顯著降低（t=5.196,P=0.0004），見圖5B，與sh-control組（0.77±0.10）相比，sh-SNHG5組細胞中miR-421表達（1.94±0.23）顯著升高（t=4.470,P=0.0010），見圖5C。通過miRcode和LncBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測到SNHG5與miR-421存在潛在的結(jié)合位點，雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與MUT-SNHG5+miR-421組及WT-SNHG5+miRcontrol組相比，WT-SNHG5+miR-421組細胞相對熒光活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

圖5 在GBM細胞中l(wèi)ncRNA SNHG5負向調(diào)控miR-421的表達Figure 5 LncRNA SNHG5 regulated negatively miR-421 expression in GBM cells

圖6 SNHG5可靶向結(jié)合miR-421Figure 6 SNHG5 targetedly interacted with miR-421

2.4 SNHG5通過靶向miR-421調(diào)控膠質(zhì)瘤母細胞瘤的增殖、侵襲與凋亡

Western blot實驗結(jié)果表明，si-SNHG5+control-inhibitor組和si-SNHG5+miR-421-inhibitor組細胞450 nm吸光度值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖7。第5天si-SNHG5+control-inhibitor組比si-SNHG5+miR-421-inhibitor組U87細胞增殖能力顯著下降（t=4.137,P=0.0033）。si-SNHG5+control-inhibitor組U87細胞凋亡比例（（17.21±2.09）%）顯著高于si-SNHG5+miR-421-inhibitor組（（7.1±1.21）%）（t=7.319,P=0.0019），見圖8A。與對照組si-SNHG5+control-inhibitor組相比，si-SNHG5+miR-421-inhibitor組中CyclinD1與Bcl-2表達水平升高（t=7.246,P=0.0019與t=6.888,P=0.0023），p21與BAX表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.392,P=0.0118與t=4.508,P=0.0108），見圖8B。si-SNHG5+control-inhibitor組U87細胞侵襲力（45.67±8.76個）明顯低于si-SNHG5+miR-421-inhibitor組（140.3±9.50個）（t=7.297,P=0.0019），見圖9。上述結(jié)果表明SNHG5是通過靶向miR-421進而促進腫瘤細胞增殖、侵襲及抑制細胞凋亡。

圖7 拯救實驗中si-SNHG5+control-inhibitor組與si-SNHG5+miR-421-inhibitor組細胞增殖能力的比較Figure 7 Comparison of cell proliferation abilities between si-SNHG5+control-inhibitor group and si-SNHG5+miR-421-inhibitor group in rescue experiments

圖8 拯救實驗中Anti-SNHG5+si-control組與si-SNHG5+miR-421-inhibitor組細胞凋亡(A)、BAX、Bcl-2、p21與CyclinD1表達水平(B)的比較Figure 8 Comparison of cell apoptosis(A) and BAX,Bcl-2,p21 and CyclinD1 expression(B) between si-SNHG5+controlinhibitor group and si-SNHG5+miR-421-inhibitor group in rescue experiments

圖9 拯救實驗中si-SNHG5+control-inhibitor組與si-SNHG5+miR-421-inhibitor組細胞侵襲能力的比較Figure 9 Comparison of cell invasion between si-SNHG5+control-inhibitor group and si-SNHG5+miR-421-inhibitor group in rescue experiments

2.5 SNHG5在體內(nèi)靶向miR-421抑制膠質(zhì)瘤母細胞瘤的生長

結(jié)果表明：sh-SNHG5+anti-control組裸鼠成瘤的體積與重量明顯低于sh-SNHG5+anti-miR-421組（t=4.821,P=0.0013;t=3.560,P=0.0074），見圖10。

圖10 拯救實驗中sh-SNHG5+anti-control組與sh-SNHG5+anti-miR-421組裸鼠成瘤體積(A)與重量(B)的比較Figure 10 Comparison of xenograft tumor volume(A) and weight(B) in nude mice between sh-SNHG5+anti-control group and sh-SNHG5+anti-miR-421 group in rescue experiments

3 討論

長鏈非編碼RNA（LncRNA）是長度超過200核苷酸（nt）的一類非編碼RNA序列，人體約4%～9%的DNA序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是LncRNA，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等各種生物學(xué)活動中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。大量研究發(fā)現(xiàn)LncRNA參與人體多種惡性腫瘤的發(fā)生與進展[6-8]。SNHG5是LncRNA家族中的一員，它在食管癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈異常表達，已被證實是一種重要的腫瘤相關(guān)因子[9-12]。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)SNHG5在GBM細胞中顯著高表達并通過激活p38/MAPK信號通路促進GBM細胞的增殖。Hu等[3]實驗證實抑制SNHG5的表達可經(jīng)Wnt/CTNNB1信號通路抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展。Meng等[14]發(fā)現(xiàn)SNHG5可靶向miR-205-5p并調(diào)控ZEB2的表達來促進膠質(zhì)瘤的增殖與侵襲。由于人體內(nèi)LncRNA作用機制廣泛，本課題組考慮SNHG5作為重要的腫瘤相關(guān)因子，是否還通過其他機制調(diào)控GBM的發(fā)生與發(fā)展？本研究經(jīng)檢索生物信息網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)SNHG5與其他miRNA存在潛在的靶向結(jié)合位點，因此，本研究從microRNA角度入手進一步探索SNHG5的作用機制。

miR-421定位于Xq13.2，其異常表達可影響與非小細胞肺癌的發(fā)生并與結(jié)直腸癌和前列腺癌的發(fā)展有關(guān)[15-17]。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-421過表達可顯著促進非小細胞肺癌細胞的增殖。Xue等[16]實驗證實miR-421可經(jīng)靶向抑制MTA1的表達進而抑制結(jié)直腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。Meng等[17]發(fā)現(xiàn)miR-421的低表達促進前列腺癌的發(fā)生并可負向調(diào)控NRAS、PRAME等表達進而影響前列腺癌的增殖與侵襲。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-421在GBM中細胞呈顯著低表達并可靶向抑制MEF2D的表達進而抑制GBM腫瘤血管的生成、細胞的糖代謝與細胞侵襲的能力。Meng等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-421可靶向抑制SP1的表達及其下游的血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）的表達進而抑制膠質(zhì)瘤的侵襲與生長。本研究利用生物信息網(wǎng)站預(yù)測出SNHG5與miR-421具有潛在的結(jié)合位點，提出SNHG5也極有可能靶向miR-421并抑制其下游機制，進而促進GBM的發(fā)生與進展的假說。首先我們利用實時熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)，GBM腫瘤標本中SNHG5與miR-421的表達呈顯著負相關(guān)；通過質(zhì)粒等轉(zhuǎn)染上調(diào)與下調(diào)U87細胞中SNHG5的表達水平，再用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-421與SNHG5的表達水平變化方向相反。為進一步探索SNHG5靶向mR-421的分子機制，本研究構(gòu)建野生型與突變型SNHG5的質(zhì)粒并利用熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實SNHG5可直接靶向結(jié)合miR-421。上述實驗說明在GBM中SNHG5可靶向miR-421并負向調(diào)控miR-421的表達。

為進一步明確GBM中SNHG5是否可通過靶向及抑制miR-421的表達而發(fā)揮其促腫瘤的作用，本研究進行拯救實驗并發(fā)現(xiàn)抑制miR-421的表達可在體內(nèi)外抵消SNHG5低表達對GBM腫瘤增殖、侵襲與抗凋亡的抑制作用。為進一步明確SNHG5靶向miR-421影響GBM細胞增殖與凋亡的機制，本實驗發(fā)現(xiàn)相比si-SNHG5+miR-421-inhibitor組，si-SNHG5+control-inhibitor組U87細胞中p21與Bax的表達水平升高，而CyclinD1與Bcl-2的表達水平降低。以上結(jié)果提示SNHG5可通過靶向miR-421再經(jīng)某種機制影響p21、Bax、CyclinD1與Bcl-2蛋白的表達，進而調(diào)控GBM細胞增殖與凋亡。SNHG5靶向miR-421影響p21、Bax等蛋白表達的機制是否與miR-421靶向抑制MEF2D的表達有關(guān)，今后將有待進一步研究[20]。

總結(jié)，LncRNA SNHG5可通過靶向miR-421促進GBM細胞增殖與侵襲并抑制其細胞凋亡，且SNHG5過表達是miR-421在GBM細胞中低表達的原因之一。本研究從microRNA的角度進一步探索了SNHG5在GBM中的作用機制，今后還將從可變剪接等其他作用機制進一步探索非編碼RNA對GBM發(fā)生與進展的調(diào)控，為GBM的基因與靶向治療提供新的思路與理論依據(jù)。