高婧琪， 張 杰， 蹇庭昆， 夏 越， 杜聞崢， 嚴(yán) 馨， 馮 甦

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610064)

1 引 言

近幾十年來(lái)，人類開(kāi)展了各種工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)，如鋼鐵生產(chǎn)、冶煉、電鍍、印刷、印染、造紙、紡織、化肥和農(nóng)藥制造等[1-2]，這些工業(yè)活動(dòng)造成了環(huán)境中的重金屬污染.在中國(guó)，潛在毒性元素污染了2000萬(wàn)公頃的耕地，約占耕地總面積的20%，其中鉻(Cr)污染地區(qū)占毒性元素污染總面積的5.1%，中國(guó)的Cr污染土壤超過(guò)總面積的1.1%[3].環(huán)境中Cr主要以兩種不同的氧化態(tài)存在，六價(jià)Cr(Ⅵ)和三價(jià)Cr (Ⅲ)[4-5]，其中Cr(Ⅵ)的毒性更大，Cr(Ⅵ)是八種對(duì)人體最有害的化學(xué)物質(zhì)之一，也是國(guó)際上公認(rèn)最具致癌性的金屬之一[6-7].長(zhǎng)時(shí)間的暴露在Cr(Ⅵ)環(huán)境中會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，損害皮膚，眼睛，血液，呼吸道和免疫系統(tǒng)[8-9].Cr(Ⅵ)可以顯著減少神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量，表現(xiàn)出神經(jīng)毒性[10].在細(xì)胞水平上，Cr(Ⅵ)的遺傳毒性作用會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激、DNA損傷和腫瘤發(fā)展的損害[11-12].

從水體中去除Cr(Ⅵ)的傳統(tǒng)方法包括物理化學(xué)方法，例如化學(xué)沉淀、膜技術(shù)、離子交換、電化學(xué)處理等[13].這些方法對(duì)于高含量Cr(Ⅵ)的去除有一定的效果，但是這些方法效率較低，價(jià)格昂貴且有容易造成二次污染的風(fēng)險(xiǎn)[14].為了克服這些問(wèn)題，生物吸附可以作為一種有效的替代方法，其中微生物吸附技術(shù)主要利用微生物的新陳代謝對(duì)重金屬進(jìn)行去除，其經(jīng)濟(jì)性與去除效率較高，且生態(tài)友好、具有可持續(xù)性，因此被認(rèn)為是一項(xiàng)很有前景的重金屬修復(fù)技術(shù)[15-16].

本實(shí)驗(yàn)以成都市雙流區(qū)某皮革廠附近受污染的土壤作為分離對(duì)象，分離得到的一株高效除Cr(Ⅵ)細(xì)菌——纖維微菌C6.用響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)優(yōu)化該菌株去除污染廢水中Cr(Ⅵ)的條件.首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到各影響因子的最佳實(shí)驗(yàn)值，探究pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間和Cr(Ⅵ)初始濃度四個(gè)因素及其交互作用對(duì)吸附作用的影響，建立Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化模型對(duì)高效除Cr(Ⅵ)細(xì)菌的去除條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳吸附條件.同時(shí)通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)和傅里葉紅外吸收光譜(FTIR)對(duì)吸附Cr(Ⅵ)前后菌體表面結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的變化進(jìn)行探究，對(duì)菌體去除Cr(Ⅵ)的機(jī)理進(jìn)行初步探討.本研究有助于為Cr(Ⅵ)污染的修復(fù)提供新的微生物吸附材料.

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 菌種 成都市雙流區(qū)某皮革廠附近污染土壤分離得到的高效除Cr(Ⅵ)細(xì)菌，該菌株具有在水體中吸附Cr(Ⅵ)的能力.

2.1.2 試劑 胰蛋白胨，氯化鈉，酵母提取物，甘油，重鉻酸鉀，硫酸，磷酸，丙酮，二苯碳酰二肼，細(xì)菌DNA提取試劑盒，細(xì)菌16S rRNA基因通用引物F27/R1492(華大基因生物公司)，戊二醛，乙醇.

2.1.3 主要溶液及試劑配制 LB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母提取物5 g，加入超純水至1 000 mL，加熱攪拌使之充分溶解，將培養(yǎng)基pH值調(diào)至7.3 ± 0.2之間.藍(lán)口瓶分裝，于121 ℃下，高壓蒸汽滅菌20 min.LB固體培養(yǎng)基加入15～20 g瓊脂，滅菌冷卻后倒平板.

Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取2.829 g在120 ℃干燥2 h至恒重的重鉻酸鉀(K2Cr2O7)，用水溶解后移入1 000 mL容量瓶，用去離子水稀釋至標(biāo)線并搖勻，配置成每毫升含1 mg的Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)溶液.

二苯碳酰二肼溶液：稱取0.2 g二苯碳酰二肼溶于50 mL丙酮中，加水稀釋至100 mL搖勻，儲(chǔ)存于棕色瓶中，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

2.1.4 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，UV-2450分光光度計(jì)(島津)，PHS-25 pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，SKY-111B搖床(上海蘇坤有限公司)，AFZ-1002-U艾科浦超純水系統(tǒng)(艾科浦公司)，立式高壓滅菌鍋(上海申安公司).

2.2 方 法

2.2.1 菌株分離 稱取污染土壤樣品10 g，放入裝有90 mL無(wú)菌水的150 mL錐形瓶中，取震蕩后的樣品溶液用無(wú)菌水依次稀釋，取稀釋的樣品溶液涂布于含有初始Cr(Ⅵ)濃度為50 mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng).挑取形態(tài)不同的單菌落平板劃線，并逐步升高LB固體培養(yǎng)基中Cr(Ⅵ)濃度，反復(fù)劃線純化，直至得到多株單一菌落.將純化之后的單一菌落寫(xiě)好編號(hào)，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?

2.2.2 Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 依次移取Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)液0.0、 0.25、 0.50、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00 mL于25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至12.5 mL標(biāo)線.向以上溶液分別加入硫酸(1+1)溶液0.5 mL和磷酸(1+1)溶液0.5 mL，加入顯色劑二苯碳酰二肼溶液2 mL，用蒸餾水稀釋至25 mL標(biāo)線，搖勻，放置10 min左右.在540 nm波長(zhǎng)處以空白試劑作為參比測(cè)定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)Cr(Ⅵ)含量為橫坐標(biāo)，繪制Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2.3 高效除Cr(Ⅵ)菌株篩選 將篩選出的多株高效耐Cr(Ⅵ)菌株分別無(wú)菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16 h作為種子液.向100 mL錐形瓶中加入含Cr(Ⅵ)濃度為50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基27 mL，將菌液調(diào)節(jié)至OD600為1.5，按10%的接種量加入到容量為100 mL錐形瓶中使總體積為30 mL.培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液離心，再分別取上清液，用二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)OD540，測(cè)定Cr(Ⅵ)含量，并計(jì)算Cr(Ⅵ)的去除率，去除率計(jì)算見(jiàn)公式：

Cr(Ⅵ)去除率(%)=(C0-Ce)/C0×100%

其中C0為初始Cr(Ⅵ)濃度，Ce為吸附后上清液中Cr(Ⅵ)含量.

比較各培養(yǎng)基中細(xì)菌對(duì)Cr(Ⅵ)的去除率，篩選出高效除Cr(Ⅵ)菌株.對(duì)菌株提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的進(jìn)行相似性分析，初步判定菌株的種屬，并在MAGE軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

2.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 研究了四個(gè)因素對(duì)菌體去除Cr(Ⅵ)效率的影響，包括溶液pH(4～11)、溫度(15～40℃)、接觸時(shí)間(0.5～5 d)、Cr(Ⅵ)初始濃度(20～120 mg/L).取上述在150 r/min搖床上培養(yǎng)一段時(shí)間Cr(Ⅵ)和菌體混合液，在4 ℃，8 000 r/min條件下離心5 min，分別取上清液0.5 mL，用二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)OD540，并計(jì)算Cr(Ⅵ)的含量和去除率，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn).

2.2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析了溶液pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間、Cr(Ⅵ)初始濃度這四個(gè)因素相互作用對(duì)菌體去除Cr(Ⅵ)效率的影響.響應(yīng)面變量因素和水平設(shè)計(jì)分別為溶液pH(6、7、8)，溫度(25、 30、 35 ℃)，反應(yīng)時(shí)間(1、 2、 3 d)，Cr(Ⅵ)初始濃度(40、 60、 80 mg/L).

2.2.6 掃描電子顯微鏡(SEM)分析 使用掃描電子顯微鏡探究纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后菌體變化，將吸附前后的菌體用PBS緩沖液沖洗3次，每次20 min，加入3%戊二醛放入4 ℃冰箱固定24 h，8 000 r/min離心5 min，用PBS緩沖液沖洗3次，然后進(jìn)行乙醇梯度脫水，分別脫水20 min；將處理好的樣品冷凍干燥1 h，噴金上機(jī)觀察.

2.2.7 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析 將吸附前后的菌體在8 000 r/min下分別離心5 min，將菌體沉淀在-40 ℃冰箱預(yù)凍4 h，再將其轉(zhuǎn)移至冷凍干燥器中凍干至固體粉末.在樣品中加入KBr，充分混勻研細(xì)后壓片，放置于傅里葉紅外吸收光譜儀上，進(jìn)行紅外光譜的檢測(cè).

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株篩選及其鑒定

如圖1所示Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系為y=0.6282x-0.0012且R2=0.9994，具有較高的相關(guān)性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)Cr(Ⅵ)含量的檢測(cè).將初步篩選得到6株耐Cr(Ⅵ)菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為C6的菌株對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率最高，達(dá)到58.13%.對(duì)該菌株進(jìn)行測(cè)序，如圖2所示，經(jīng)過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果顯示，C6屬于纖維微菌屬，故將其命名為纖維微菌C6，纖維微菌屬是一種放線菌，其特點(diǎn)是具有分解木質(zhì)纖維素的能力[17]，選取該菌株作為本研究所需菌株開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖1 Cr(Ⅵ)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for Cr(Ⅵ)

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 接觸時(shí)間對(duì)纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同接觸時(shí)間下纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除的影響，設(shè)置接觸時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、3、4、5 d，其他反應(yīng)條件選取如下：pH=7，溫度 35 ℃，Cr(Ⅵ)初始濃度為20 mg/L.如圖3所示，隨著接觸時(shí)間的增加，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除的過(guò)程主要分為兩個(gè)階段：第一階段在0～2 d內(nèi)，去除效率增加趨勢(shì)明顯，2～5 d去除效率達(dá)到平衡狀態(tài)，在第2 d達(dá)到最大去除效率92.27%，因此采用接觸時(shí)間2 d用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖2 C6菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of C6 strain

3.2.2 pH對(duì)纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同pH下纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除的影響，設(shè)置pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11， 其他反應(yīng)條件選取如下：溫度 35 ℃，Cr(Ⅵ)初始濃度為20 mg/L，接觸時(shí)間2 d.如圖4所示，在pH 4～7，隨著pH增大，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)的去除效率增加；在pH 7～11隨著pH增大 Cr(Ⅵ)的去除效率逐漸減小，在pH為7時(shí)達(dá)到最適去除條件，去除效率為92.23%，因此采用pH為7用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

3.2.3 溫度對(duì)纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同溫度下纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除的影響，設(shè)置溫度分別為15、20、25、30、35、40 ℃，其他反應(yīng)條件選取如下：pH 7，Cr(Ⅵ)初始濃度為20 mg/L，接觸時(shí)間2 d.如圖5所示，在15～30 ℃，隨著溫度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率增加，在30 ℃達(dá)到最適去除溫度，最高去除效率達(dá)到93.89%，在30～40 ℃去除效率基本處于平衡狀態(tài)，采用溫度30 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖4 pH對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的影響Fig.4 Effect of pH Cr(Ⅵ) removal efficiency

圖5 溫度對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的影響

3.2.4 Cr(Ⅵ)初始濃度對(duì)纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同Cr(Ⅵ)初始濃度下纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除的影響，設(shè)置Cr(Ⅵ)初始濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L.其他反應(yīng)條件選取如下：pH 7，接觸時(shí)間2 d，溫度30 ℃.如圖6所示，在初始濃度為20～60 mg/L時(shí)，隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率增加，在60 mg/L達(dá)到最適去除初始濃度，去除效率為94.77%；在60～120 mg/L范圍內(nèi)，隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率先下降后逐漸達(dá)到平衡狀態(tài).

圖6 Cr(Ⅵ)初始濃度對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的影響

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取4個(gè)顯著的影響因素作為對(duì)象，利用Design-Expert軟件對(duì)纖維微菌C6設(shè)計(jì)了29組4獨(dú)立因素Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，如表1所示.運(yùn)用Design-Expert8.0.5.0軟件，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到二元回歸方程式為:

Y=+74.86-0.48A+4.18B+3.25C-

1.64D+3.49AB+0.70AC-4.02AD+

3.92BC-4.39BD+1.36CD+0.29A2+

3.83B2-5.22C2+3.19D2

表1 纖維微菌C6去除率響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2以纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)的去除率作為響應(yīng)值對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表可知模型P值為0.004 2<0.050 0，回歸顯著，表明擬合的二次多項(xiàng)回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義有良好的預(yù)測(cè)能力.回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.82表明該模型的擬合程度較好，回歸模型失擬項(xiàng)P值為0.2348>0.05，失擬不顯著，表明模型沒(méi)有異常數(shù)據(jù)，能很好地進(jìn)行預(yù)測(cè).

表2 二元回歸方程的方差分析

殘差分析可以進(jìn)一步檢驗(yàn)回歸模型的正確性.若殘差分布圖中的數(shù)據(jù)點(diǎn)呈現(xiàn)線性趨勢(shì)分布，則表示殘差服從正態(tài)分布.殘差的正態(tài)概率圖如圖7a所示，殘差數(shù)據(jù)點(diǎn)在直線兩側(cè)分布均勻，表明殘差服從正態(tài)分布，即回歸模型準(zhǔn)確.空間中某一點(diǎn)的所有參數(shù)對(duì)響應(yīng)的影響可以根據(jù)圖7b所示的攝動(dòng)圖進(jìn)行評(píng)估.溫度(B)和接觸時(shí)間(C)的陡坡表明Cr(Ⅵ)去除率的響應(yīng)對(duì)此因素很敏感.pH(A)接近平坦曲線對(duì)Cr(Ⅵ)去除率的敏感性較低.因此溫度和接觸時(shí)間是影響Cr(Ⅵ)去除率的關(guān)鍵因素.

圖7 纖維微菌C6去除Cr (VI)的殘差正態(tài)概率和擾動(dòng)

根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果繪制出響應(yīng)面曲線等高圖如圖8所示，圖8a顯示了溫度和溶液pH對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用.當(dāng)溫度在30 ℃以下，溶液pH 5～7時(shí)，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除率較高；在32～40 ℃、溶液pH 7～9的范圍內(nèi)Cr(Ⅵ)去除率隨著溫度和溶液pH的增加而增加.圖8b顯示了接觸時(shí)間和溶液pH對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，如圖8b所示，在溶液pH 5～9時(shí)，Cr(Ⅵ)去除率隨著接觸時(shí)間的增加而增大.在pH為7，接觸時(shí)間為2 d時(shí)達(dá)到最佳去除效率.圖8c顯示了Cr(Ⅵ)初始濃度和溶液pH對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，當(dāng)溶液pH 7～9時(shí)，Cr(Ⅵ)初始濃度為40～50 mg/L時(shí)或當(dāng)溶液pH 5～7時(shí)，Cr(Ⅵ)初始濃度為65～80 mg/L時(shí)，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除率隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加而增大.圖8d顯示了溫度和接觸時(shí)間對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，如圖8d顯示，在30～40 ℃的范圍內(nèi)，隨著接觸時(shí)間的增加，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除率也在增加.圖8e顯示了溫度和Cr(Ⅵ)初始濃度對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，在30～40 ℃的范圍內(nèi)，隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除率在減少.圖8f顯示了接觸時(shí)間和Cr(Ⅵ)初始濃度對(duì)Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，在Cr(Ⅵ)初始濃度40～60 mg/L時(shí)，隨著接觸時(shí)間的增加和Cr(Ⅵ)初始濃度的減小，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除率增加.

在最佳吸附條件下，即pH為7.85，溫度34.07 ℃，接觸時(shí)間2.88 d，初始Cr(Ⅵ)濃度40.08 mg/L，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)的去除率達(dá)到最高為95.75%.

3.4 纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后SEM分析

如圖9a所示，在沒(méi)有Cr(Ⅵ)處理的條件下，纖維微菌C6菌體細(xì)胞呈短桿狀，表面清晰光滑且分散.如圖9b所示，Cr(Ⅵ)處理過(guò)的菌體表面不規(guī)則，有顆粒狀沉淀，并且菌體細(xì)胞排列在一起形成粘連的結(jié)構(gòu).這種由Cr(Ⅵ)脅迫引起的菌株形態(tài)變化可能在細(xì)菌防御外部Cr(Ⅵ)毒性和Cr(Ⅵ)在細(xì)菌細(xì)胞表面的吸附機(jī)制中起關(guān)鍵作用.細(xì)菌表面吸附的Cr會(huì)引起細(xì)菌表面形態(tài)的變化.相同的情況也在Karthik等人[18]的研究結(jié)果中出現(xiàn).

3.5 纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后FTIR分析

為了研究Cr(Ⅵ)與纖維微菌C6相互作用中可能涉及的官能團(tuán)，對(duì)纖維微菌C6菌體與Cr(Ⅵ)反應(yīng)前后進(jìn)行了紅外光譜分析.如圖10所示，在3 274 cm-1觀察到的波段對(duì)應(yīng)于O-H拉伸振動(dòng)[18]，與Cr(Ⅵ)反應(yīng)后的紅外光譜圖O-H拉伸移至較高的頻率3 417 cm-1.在1 680～1 630 cm-1、1 545～1 530 cm-1處的改變與酰胺I的C=O拉伸和酰胺II的N-H的拉伸振動(dòng)有關(guān)[19]，此處反應(yīng)前分別為1 635和1 540，反應(yīng)后的特征峰發(fā)生漂移變?yōu)? 646和1 546 cm-1.胺分子中的C-N鍵伸縮振動(dòng)區(qū)為1 360～1 020cm-1，此范圍內(nèi)吸收峰由1 216和1 072 cm-1分別變?yōu)榱? 238和1 078 cm-1.從以上結(jié)果可以看出，羧基、酰胺Ⅰ(C=O鍵)、酰胺Ⅱ(N-H鍵)、C-N鍵可能參與了生物吸附過(guò)程.

圖9 纖維微菌C6吸附Cr(Ⅵ)前后的SEM分析 (a)吸附前;(b)吸附后.Fig.9 SEM images of Cellulosimicrobium sp. strain C6 (a) Before adsorption; (b) after adsorption.

圖10 纖維微菌C6吸附Cr(Ⅵ)前后傅里葉紅外光譜分析 Fig 10 FTIR analysis before and after removal Cr(Ⅵ) by Cellulosimicrobium sp. strain C6

4 討 論

隨著重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，新型的微生物修復(fù)技術(shù)有著越來(lái)越重要的地位，微生物修復(fù)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：修復(fù)效果較理想、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、環(huán)境友好等[16].本研究對(duì)成都市雙流區(qū)某皮革廠附近污染土壤進(jìn)行分離和純化，得到一株菌株：纖維微菌C6.單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)具有較高的去除能力.響應(yīng)面法是一種可靠的、功能強(qiáng)大的生物吸附過(guò)程中建模和優(yōu)化工具[20].根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，基于Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法通過(guò)纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)去除條件的優(yōu)化，建立了響應(yīng)與自變量之間的關(guān)系.結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好，同時(shí)溫度和接觸時(shí)間是影響生物吸附過(guò)程中最重要的參數(shù).掃描電鏡表明，細(xì)菌表面有顆粒狀沉淀，可能是通過(guò)吸附作用達(dá)到對(duì)Cr(Ⅵ)的去除效果.紅外光譜也證明了與Cr(Ⅵ)反應(yīng)后，細(xì)胞表面的羧基、酰胺Ⅰ(C=O鍵)、酰胺Ⅱ (N-H鍵)、C-N鍵可能參與了生物吸附過(guò)程.Karthik等人[18]也對(duì)纖維微菌屬的菌株去除Cr(Ⅵ)的機(jī)理進(jìn)行過(guò)討論，溶液中Cr(Ⅵ)通過(guò)與細(xì)胞表面官能團(tuán)的配位而被吸附在細(xì)胞表面，形成顆粒狀沉淀，再通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)部的積累.此前尹華等[21]研究表明紅螺菌R-04對(duì)Cr(Ⅵ)吸附率為84%，根霉菌對(duì)Cr(Ⅵ)吸附率為60%～80%，而本研究中纖維微菌C6對(duì)Cr(Ⅵ)的去除效率高達(dá)95.75%，表明纖維微菌C6具有優(yōu)異的Cr(Ⅵ)去除性能，在去除水體重金屬污染中具有較大的優(yōu)勢(shì).現(xiàn)在已經(jīng)有相關(guān)研究對(duì)去除污染物的微生物進(jìn)行固定化處理從而制備成具有高效去除能力的固定化生物吸附劑，該技術(shù)有利于將游離的微生物菌體固定起來(lái)達(dá)到對(duì)水體中重金屬的去除[22]，本研究中篩選的菌株也具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的價(jià)值.