馮具攀，魏開金，徐 進(jìn)，于瑤瑤，徐 濱，馬寶珊，朱祥云

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦，是我國(guó)目前養(yǎng)殖規(guī)模最大的淡水養(yǎng)殖蝦類，2019年養(yǎng)殖面積超過128萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)208.96萬t，經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值4 110億元[1]。在養(yǎng)殖和運(yùn)輸過程中，克氏原螯蝦會(huì)面臨著各種不同形式的應(yīng)激因子，如水溫、鹽度、溶氧、氨氮、pH值、亞硝酸鹽以及水體污染等[2]。其中以高溫應(yīng)激最常見、危害最大?？耸显r的最適生長(zhǎng)溫度為21～28 ℃[3]，前期研究結(jié)果顯示，水溫超過30 ℃即可引起克氏原螯蝦機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，造成克氏原螯蝦生理機(jī)能紊亂[4]，導(dǎo)致其免疫力和抗病力顯著下降[5]。如何避免或緩解高溫應(yīng)激造成的不良影響，提高克氏原螯蝦的抗應(yīng)激能力，是目前亟需解決的問題。

谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine，glutathione，GSH)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種同時(shí)具有γ-谷氨酰基和巰基的生物活性三肽化合物，是一種天然的抗氧化劑，能增強(qiáng)動(dòng)物的免疫和抗氧化能力[6]。谷胱甘肽在自然界中以還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)兩種形式存在，主要活性成分是還原型谷胱甘肽，因此，通常所說的谷胱甘肽主要指的是還原型谷胱甘肽[7]。GSH在細(xì)胞內(nèi)是谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的特有底物，能促進(jìn)二者的合成而清除過氧化物和氧自由基，以維持細(xì)胞的正常生理功能[8]。GSH能否提高克氏原螯蝦的抗高溫應(yīng)激能力尚未可知。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)GSH對(duì)克氏原螯蝦抗高溫應(yīng)激能力和生長(zhǎng)的影響，為產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

克氏原螯蝦來自長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所梁子湖實(shí)驗(yàn)基地。實(shí)驗(yàn)選擇健康、活力高、規(guī)格基本一致，初體重為(7.74±0.5) g的克氏原螯蝦。還原型谷胱甘肽購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，含量99%。

1.2 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)分6個(gè)組，其中5個(gè)添加組和一個(gè)空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組克氏原螯蝦30尾?？瞻讓?duì)照組投喂市售常規(guī)商品飼料(不含GSH)，添加組在商品飼料中分別添加0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 g/kg GSH。實(shí)驗(yàn)蝦暫養(yǎng)1周后開始養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，以蝦體重的5.0%投喂。每天在8:00～8:30、19:00～19:30各投喂1次，當(dāng)?shù)睾铀魉B(yǎng)殖，養(yǎng)殖期間24 h持續(xù)增氧，及時(shí)清污。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后，對(duì)每組實(shí)驗(yàn)蝦進(jìn)行稱重，計(jì)算平均體重增重率和飼料系數(shù)。

體重增重率=(實(shí)驗(yàn)?zāi)┪r體質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)前蝦體質(zhì)量)/實(shí)驗(yàn)前蝦體質(zhì)量×100%

飼料系數(shù)=飼料消耗量/增重量

1.3 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)及樣本采集和測(cè)定

飼養(yǎng)6周后，開始高溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。將各組實(shí)驗(yàn)蝦分別放入35 ℃水溫的實(shí)驗(yàn)盆中連續(xù)應(yīng)激48 h。應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)增氧，并減少人為干擾。在應(yīng)激前(0 h)及應(yīng)激后6、12、24、48 h，每個(gè)平行組隨機(jī)取3尾蝦采集血淋巴液，每個(gè)濃度組9個(gè)樣本。將蝦迅速撈起并立即用1 mL注射器在圍心腔采取血淋巴，采用等體積的肝素鈉溶液(0.02 g/mL)抗凝。血淋巴液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取上清液于-80 ℃保存待用。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSH-T)、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件單因素方差分析(one way ANOVA)和DUNCAN多重比較[9]，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦血淋巴抗氧化指標(biāo)的影響

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)結(jié)果顯示(表1)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蝦血淋巴中GSH-T含量無顯著差異。0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激6 h后血淋巴中的GSH-T含量比對(duì)照組顯著增加，0.24 g/kg濃度組在應(yīng)激12 h后血淋巴中的GSH-T含量比對(duì)照組顯著增加，而低于此添加濃度，GSH對(duì)GSH-T的影響不明顯。添加組血淋巴中GSH-T含量在應(yīng)激后至24 h呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，并在24 h大幅提升到最大值，隨后降低，趨于穩(wěn)定。

表1 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦血淋巴中GSH-T的影響

總抗氧化能力的檢測(cè)結(jié)果顯示(表2)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蝦血淋巴中T-AOC水平無顯著性差異。0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激6 h后血淋巴中的T-AOC含量比對(duì)照組顯著增加，0.24 g/kg濃度組在應(yīng)激12 h后血淋巴中的T-AOC含量比對(duì)照組顯著增加，而低于此添加濃度，GSH對(duì)T-AOC的影響不明顯。添加組血淋巴中T-AOC含量在應(yīng)激后總體上呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，應(yīng)激后12 h達(dá)到最高值。

表2 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦血淋巴中總抗氧化能力的影響

總超氧化物歧化酶的檢測(cè)結(jié)果顯示(表3)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)蝦血淋巴中的T-SOD水平無顯著性差異。與對(duì)照組相比，0.24 g/kg和0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激后6 h，T-SOD水平顯著升高；0.18 g/kg濃度組在應(yīng)激后24 h，T-SOD水平顯著升高；而0.06 g/kg和0.12 g/kg添加組在應(yīng)激后血淋巴中的T-SOD水平與對(duì)照組無顯著性差異。添加組血淋巴中T-SOD水平在應(yīng)激后總體上呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，應(yīng)激后6 h達(dá)到峰值，12 h后降至低于應(yīng)激前水平。

表3 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦血淋巴中總超氧化物歧化酶的影響

過氧化氫酶的測(cè)定結(jié)果顯示(表4)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組蝦血淋巴中的CAT含量無顯著性差異。與對(duì)照組相比，0.24 g/kg和0.30 g/kg濃度組在應(yīng)激后6 h，CAT水平顯著升高；而低于0.24 g/kg的添加組應(yīng)激后血淋巴中的CAT水平與對(duì)照組無顯著性差異。各實(shí)驗(yàn)組血淋巴中CAT水平在應(yīng)激后總體上呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，應(yīng)激后12 h達(dá)到峰值，隨后回落至應(yīng)激前水平。

表4 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦血淋巴中過氧化氫酶的影響

丙二醛的測(cè)定結(jié)果顯示(表5)，應(yīng)激前各實(shí)驗(yàn)組蝦血淋巴中的MDA含量無顯著性差異。各實(shí)驗(yàn)組蝦血淋巴中MDA含量在應(yīng)激后呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在應(yīng)激后12 h達(dá)到最大值，而后逐漸降低，趨于穩(wěn)定。0.24 g/kg和0.30 g/kg濃度組MDA含量在應(yīng)激后12 h均比對(duì)照組顯著降低，0.12 g/kg和0.18 g/kg濃度組MDA含量在應(yīng)激后24 h均比對(duì)照組顯著降低，48 h后差異不顯著。

表5 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦血淋巴中丙二醛的影響

2.2 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組實(shí)驗(yàn)蝦的體重進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示(表6)，除了0.06 g/kg添加組的實(shí)驗(yàn)蝦的增重率與對(duì)照組無顯著性差異外，其它添加組均比對(duì)照組有顯著性提升；0.18、0.24、0.30 g/kg添加組的飼料系數(shù)比對(duì)照組顯著降低。其中0.30 g/kg添加組的增重率最高，飼料系數(shù)最低。

表6 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響

3 討論

3.1 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦抗氧化能力的影響

動(dòng)物應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生超量的活性氧自由基，從而引發(fā)機(jī)體內(nèi)部的新陳代謝失調(diào)，使動(dòng)物的健康和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)受到很大影響。動(dòng)物體內(nèi)存在著抗氧化物酶，如谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等，可以清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，并且這些抗氧化酶活性的提高也有助于緩解多不飽和脂肪酸氧化、亞硝酸鹽應(yīng)激、饑餓、溫度變化產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[10]。本實(shí)驗(yàn)投喂谷胱甘肽能顯著提高克氏原螯蝦血淋巴中各抗氧化酶的水平，表明機(jī)體的抗氧化能力得到增強(qiáng)。MDA是膜脂過氧化的最重要產(chǎn)物之一，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，因而具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害[11,12]。因此，檢測(cè)MDA的含量能了解膜脂的過氧化程度，評(píng)估氧化應(yīng)激的危害程度。本實(shí)驗(yàn)中投喂谷胱甘肽能顯著降低克氏原螯蝦在高溫應(yīng)激時(shí)血淋巴中的MDA含量，表明谷胱甘肽能有效提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力，降低高溫應(yīng)激造成的氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其它水產(chǎn)動(dòng)物的研究結(jié)果一致。研究資料顯示，飼料中添加適量谷胱甘肽可顯著提高草魚(Ctenopharyngodonidellus)肝臟谷胱甘肽水平、谷胱甘肽過氧化物酶活力和超氧化物歧化酶活力，顯著增強(qiáng)草魚的抗氧化能力、非特異性免疫力以及生長(zhǎng)性能[13-16]。在吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)上的研究顯示，飼料添加0.24g/kg谷胱甘肽可顯著提高吉富羅非魚肝臟谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活力、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力和過氧化氫酶活力，并且顯著降低丙二醛含量[17]。谷胱甘肽能顯著提高凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[18]、皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)[19]肝胰腺中抗氧化酶活力以及總抗氧化能力。

3.2 谷胱甘肽對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的影響

已有許多研究表明，谷胱甘肽對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。周艷玲[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中谷胱甘肽添加量的增加，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的增重率會(huì)呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，生長(zhǎng)指標(biāo)在添加量為0.30 g/kg時(shí)達(dá)到最大值，且添加組均顯著高于對(duì)照組。飼料中添加適量谷胱甘肽可使草魚的特定生長(zhǎng)率和存活率顯著提高并且降低飼料系數(shù)，添加量為300 mg/kg時(shí)特定生長(zhǎng)率最高,比對(duì)照組提高10.08%[15]。劉曉華等[21]研究表明，在凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)日糧中添加適量谷胱甘肽，能夠顯著提高其增重率和飼料轉(zhuǎn)化效率，并且各添加組的成活率均顯著高于對(duì)照組。當(dāng)飼料中谷胱甘肽添加量為0.18 g/kg時(shí)增重率達(dá)到最大值。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了添加量大于0.18 g/kg的谷胱甘肽能顯著提高克氏原螯蝦的增長(zhǎng)率，降低餌料系數(shù)。對(duì)于谷胱甘肽的促生長(zhǎng)機(jī)制，已有研究表明，谷胱甘肽能上調(diào)類胰島素生長(zhǎng)因子Ⅰ和生長(zhǎng)激素基因的表達(dá),增加生長(zhǎng)激素、甲狀腺激素和類胰島素生長(zhǎng)因子I的分泌，促進(jìn)羅非魚的生長(zhǎng)[17,22,23]。除了促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌，我們推測(cè)谷胱甘肽的促生長(zhǎng)作用也跟其抗應(yīng)激作用相關(guān)。前期研究結(jié)果顯示，克氏原螯蝦在高溫應(yīng)激時(shí)，機(jī)體會(huì)大量消耗葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂肪來應(yīng)對(duì)和消除應(yīng)激的不良影響[3]，而谷胱甘肽能有效降低機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，減少了上述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，間接促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累和體重的增加。谷胱甘肽的促生長(zhǎng)機(jī)制，還需從物質(zhì)能量代謝的角度做進(jìn)一步研究和探討。