魯翠云，杜雪松，鄭先虎，李 超，程 磊，孫志鵬，孫效文，陳 忠

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院，南寧 530021)

鯉(CyprinuscarpioL.)在我國具有悠久的養(yǎng)殖和選育歷史，形成了許多極具地方特色的優(yōu)良種質，禾花鯉就是華南一帶適合稻田養(yǎng)殖的特色地方種質，因其在稻田中養(yǎng)殖，采食落水禾花而得名。經(jīng)過長期的環(huán)境適應和定向選育，不同區(qū)域又選育出了不同的禾花鯉地方品系，例如桂林品系、華南鯉、石鯉等，普遍具有的特點是頭小腹圓、不善跳躍、易捕撈，適合稻田養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境[1]。近幾年，稻漁綜合種養(yǎng)模式在全國迅速推廣，2018年已經(jīng)有27個省份開展了稻漁綜合種養(yǎng)，水產(chǎn)品產(chǎn)量達到233萬噸，比2017年增加了19.81%，其中以鯉、鯽為主養(yǎng)魚類的稻田養(yǎng)魚占42.10%[2]。金邊鯉(Cyprinuscarpiovar.Jinbian，暫定名)是由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)引育種中心聯(lián)合多家單位針對稻田養(yǎng)殖從融水田鯉中選育出的禾花鯉新品系，因背鰭兩側從頭部頂端到尾部的皮膚為金色，似一條金邊而得名，具有肉多刺柔、肉質鮮美、無腥味等特點[3]，研究表明稻田養(yǎng)殖金邊鯉的肌肉品質優(yōu)勢明顯[4]，市場價格較高，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)開發(fā)前景。

在品種選育和使用過程中注重對遺傳多樣性的保護，最大限度地避免近親繁殖不僅能夠優(yōu)化種群結構、提高生產(chǎn)性能，還能夠延長選育品種的使用壽命。因此，對親本群體進行遺傳多樣性評估，制定有效的繁殖配組策略就成為重點?；谟H本間遺傳距離的鯉分子育種技術已經(jīng)開發(fā)多年，其中以微衛(wèi)星標記計算的遺傳距離指導家系和群體選育已經(jīng)在鯉[5,6]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[7]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[8]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[9]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[10]等選育中進行了應用，取得了良好的選育效果。研究表明隨著親本間遺傳距離的增加，家系平均體質量等生長性狀呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，選擇遺傳距離中等的親本更易于獲得優(yōu)良家系[5]；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，選育親本群體雌、雄個體間遺傳距離也呈現(xiàn)出正態(tài)分布的特點，選擇遺傳距離中間值作為配組的依據(jù)切實可行[11]?；诜肿訕擞浀倪z傳距離預測子代的生長優(yōu)勢在農作物開展的研究較多，研究表明使用與目標性狀緊密連鎖的功能基因標記或QTL標記計算遺傳距離能夠增強預測效果[12,13]。然而，以往在評估鯉親本個體間遺傳差異時，使用的多為隨機多態(tài)的微衛(wèi)星標記，缺乏與目標性狀的關聯(lián)性。隨著鯉基因組資源的開發(fā)[14]，與生長性狀緊密連鎖的QTL標記已經(jīng)積累了很多，其中不乏在鯉品種間共享的QTL標記[15,16]。本研究用24個與體質量、體長等生長性狀相關的QTL標記對金邊鯉親本群體進行遺傳評估，分析雌、雄個體間的遺傳距離分布，為金邊鯉的繁殖配組及持續(xù)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從廣西壯族自治區(qū)融水地區(qū)收集背鰭兩側從頭部頂端至尾鰭基部有完整金色鱗片的個體組成金邊鯉基礎群體，養(yǎng)殖于廣西農業(yè)良種海南南繁育種基地。選擇體形勻稱、無傷病且性腺發(fā)育良好的個體192尾組成親魚群體，其中雌性個體86尾，雄性個體106尾。對每尾親魚植入電子標記，記錄每個樣本電子標記號，并剪取部分鰭條組織，編號后置于濾紙晾干，以備提取基因組DNA[17]。

1.2 微衛(wèi)星標記篩選

從鯉高密度連鎖圖譜及鏡鯉生長性狀顯著相關的QTL標記中篩選24個用于金邊鯉親本群體的遺傳分析[14,15]。這些標記分布于11個連鎖群，其中2個連鎖群含有鏡鯉與建鯉共享QTL區(qū)間，12個標記是鏡鯉與建鯉共享QTL標記[15]，在鯉種間具有較好的保守性和適用性(表1)。

表1 鯉QTL標記所在連鎖群與生長性狀的相關性

1.3 PCR擴增及檢測

用組織基因組DNA提取試劑盒(天根生物)從鰭條組織中提取金邊鯉基因組DNA，紫外分光光度計定量后稀釋成50 ng/μL。采用毛細管凝膠電泳技術檢測192個樣本的基因型，在正向引物的5′端標記藍色(FAM)、綠色(HEX)或黃色(TAMRA)熒光，PCR反應體系含有10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP、0.2 mmol/L上下游引物、1 U Taq DNA聚合酶及100 ng DNA模板。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。反應結束后，各取0.7 μL的三色熒光PCR產(chǎn)物(共2.1 μL)，5.9 μL的Hi-DiTM甲酰胺和0.1 μL LIZ-500制備成電泳混合樣。將混合樣置于PCR儀上于95 ℃變性5 min，立即置于冰上冷卻5 min，在3730XL遺傳分析儀(ABI)上進行毛細管凝膠電泳，電泳結束后利用GeneMap-per V4.1軟件進行圖像收集和數(shù)據(jù)分析，建立個體基因型檔案。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件“魚類種質資源遺傳分析裝置(ZL200710144749.3)”進行數(shù)據(jù)轉換，用PopGene32(Version 3.2)軟件計算每個微衛(wèi)星標記的等位基因頻率(P)、等位基因數(shù)(No)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)。標記的多態(tài)性信息含量(PIC)按照Botstein等[18]的方法計算，公式如下：

其中，n為某一位點上等位基因數(shù)，Pi、Pj分別為第i和第j個等位基因在群體中的頻率，j=i+1。

用GenePop(Version 4.7)軟件進行χ2檢驗估計群體Hardy-Weinberg平衡偏離。用PopGene32軟件計算每個位點群體的近交系數(shù)(Fis)，近交系數(shù)為正值表明群體在該位點雜合子缺失，負值表明該位點雜合子過剩。用NeEstimator(version 2.1)軟件采用連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)方法估算有效群體大小。

運行PHYLIP(version3.695)軟件的gendist程序，計算兩兩雌、雄個體間的遺傳距離，用neighbor程序繪制基于鄰接法(neighbor joining method，NJ)的聚類圖，劃分繁殖組，并用Arlequin 3.11軟件中的分子方差分析(AMOVA)計算繁殖組間的遺傳變異組成及兩兩繁殖組間的遺傳分化系數(shù)(Fst)。

2 結果

2.1 擴增情況

24個QTL標記在金邊鯉親本群體擴增獲得清晰、穩(wěn)定的條帶，并在個體間表現(xiàn)出多態(tài)性。擴增的片段大小為100～310 bp，各標記檢測到的等位基因數(shù)(No)在4個(HLJ3579)到12個(HLJ1944)之間，共檢測到184個等位基因，群體平均等位基因數(shù)為7.667個。根據(jù)Botstein等[18]對標記多態(tài)水平的劃分標準，22個標記為高度多態(tài)(PIC≥0.5)，只有HLJ2300和CAFS882分別為中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.5)和低度多態(tài)(PIC<0.25)水平的標記。

2.2 親本群體遺傳結構分析

用24個QTL標記分析了金邊鯉親本群體的遺傳結構，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.170～7.132，平均為3.941；觀測雜合度(Ho)為0.156～0.859，平均為0.590；期望雜合度(He)為0.146～0.862，平均為0.707；多態(tài)信息含量(PIC)為0.138～0.845，平均為0.670，結果顯示金邊鯉親本群體處于高度多態(tài)水平(PIC≥0.5)。

對金邊鯉親本群體進行Hardy-Weinberg遺傳平衡評估，結果經(jīng)Bonferroni校正顯著性閾值后，群體尚有10個位點顯著或極顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，其中HLJ2456、HLJ3271、HLJ2387等9個位點表現(xiàn)為雜合子極顯著缺失(P<0.000 4)。群體近交系數(shù)能夠直觀地表現(xiàn)出雜合子的缺失或過剩，結果群體在19個位點出現(xiàn)雜合子不同程度的缺失，占79.17%；僅5個位點表現(xiàn)為雜合子過剩。采用LD方法估算金邊鯉親魚有效群體大小為113.6尾(CI95%)。具體統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。

表2 金邊鯉親本群體在24個QTL標記的遺傳多樣性參數(shù)

續(xù)表2

2.3 親本群體雌雄個體間遺傳距離分布及繁殖組間的遺傳分化

用24個QTL標記分析了金邊鯉親本群體雌、雄個體間的遺傳距離分布，結果雌、雄個體間遺傳距離位于0.1231～1.8563之間，遺傳距離呈正態(tài)分布，其中峰值位于0.7～0.9之間，占38.36%(圖1)。基于個體間遺傳距離的NJ聚類圖將親本個體聚為5個大小不等的分支，顯示出群體內出現(xiàn)一定程度的遺傳分化(圖2)，結合育種實際將親本群體劃分為3個繁殖組，Group I包含24尾雌魚和36尾雄魚；Group II包含34尾雌魚和50尾雄魚；Group III包含28尾雌魚和20尾雄魚。

圖1 金邊鯉親本群體雌、雄個體間遺傳距離分布圖

圖2 金邊鯉親本群體基于NJ算法的個體間聚類圖

對3個繁殖組進行遺傳變異分析，結果2.67%的遺傳變異來自繁殖組間(表3)。繁殖組間遺傳分化系數(shù)為0.025 48(Group II和Group III)～0.035 09(Group I和Group III)，兩兩繁殖組間的遺傳分化系數(shù)均達到了顯著水平(P<0.05)。

表3 繁殖組間遺傳變異的分子方差分析

3 討論

3.1 關于金邊鯉親魚群體的遺傳多樣性問題

本研究用24個與生長性狀相關的QTL標記分析金邊鯉親本群體的遺傳結構及遺傳分化，結果群體平均等位基因數(shù)(No=7.667)顯著高于有效等位基因數(shù)(Ne=3.941)，表明群體在生長性狀相關的位點還沒有顯著受到選擇育種的影響，仍然保持了豐富的稀有等位基因，在生長性狀相關位點尚未顯示出明顯的富集效應。群體平均觀測雜合度(Ho=0.590)顯著低于期望雜合度(He=0.707)，表明群體已經(jīng)出現(xiàn)了一定比例的雜合子缺失。Hardy-Weiberg平衡檢驗近交系數(shù)的結果也表明：群體在19個(79.17%)QTL位點出現(xiàn)不同程度的雜合子缺失，9個(37.50%)位點出現(xiàn)極顯著的雜合子缺失，顯示出人工選擇的跡象。群體多態(tài)信息含量能夠直觀地反映出群體遺傳多樣性水平，按照Botstein等[18]的劃分標準，金邊鯉親本群體處于高度多態(tài)水平(PIC=0.670>0.5)，遺傳多樣性較好，具備進一步生產(chǎn)及選育優(yōu)良品種的遺傳潛力，同時也體現(xiàn)出金邊鯉主要以外形為選育目標，而以生長為目標的選育尚未完成。

潘賢輝等[19]用mtDNA分析的結果表明金邊鯉與禾花鯉桂林品系和野鯉分化顯著，且遺傳多樣性低于二者。甘寶江等[20]用10個微衛(wèi)星標記的分析結果表明：雖然金邊鯉群體處于高度多態(tài)水平，但是卻低于黑龍江和太湖野生鯉群體、福瑞鯉和建鯉等養(yǎng)殖群體，且與兩者具有中等程度的遺傳分化。本研究用QTL標記計算的金邊鯉群體5項遺傳參數(shù)均低于甘寶江等[20]的分析結果，分析原因一方面QTL標記因與性狀緊密連鎖而具有較高的保守性，多態(tài)性水平相對較低；另一方面群體遺傳多樣性的分析結果不僅受群體遺傳背景的影響，樣本量、標記數(shù)量、標記多態(tài)性水平、標記類型、分型技術等因素也對分析結果具有較大的影響[21,22]。朱華平等[23]的研究發(fā)現(xiàn)華南鯉F5的遺傳多樣性低于地方品種，且隨著選育世代的增加，遺傳多樣性參數(shù)呈現(xiàn)逐代下降的趨勢[24]，其中F5平均等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量較F1分別降低了28.17%和15.36%，認為人工選育加快了華南鯉選育品種與地方品種的遺傳分化，也導致了選育品種遺傳多樣性下降。因此，金邊鯉在選育過程中，要特別注意對選育親魚群體遺傳多樣性的保護，以提高選育效率，保持良種的生產(chǎn)性能，延長良種的使用壽命。

3.2 關于親本間遺傳距離分布規(guī)律及配組問題

基于分子標記估算的親本遺傳差異指導繁殖配組的育種技術已經(jīng)開發(fā)了成套的選育種軟件[25]，在多個物種的推廣應用中取得了良好的選育效果。面對龐大的基因組資源，如何選擇標記用于遺傳背景的評估是需要考慮的問題。以往的研究對標記的選擇多帶有隨機性，然而，由于微衛(wèi)星標記遍布整個基因組，隨機選擇微衛(wèi)星標記計算的遺傳距離雖然能夠反映親本間的遺傳差異，但是卻不能反映親本間在目標性狀的遺傳差異，而大量與研究目標性狀無關的位點也將稀釋遺傳距離與目標性狀間的相關性。

本研究參考周康奇等[26]的研究結果，用鯉體質量、體長、體高和體厚4個性狀的QTL標記評估了金邊鯉親本間遺傳距離，提高以生長性狀為目標的選配效率。結果雌、雄個體間遺傳距離呈正態(tài)分布，峰值位于0.7～0.9，高于鏡鯉和豫選黃河鯉[5,11]，低于福瑞鯉和半滑舌鰨[10,11]。綜合以上幾種魚類親本個體間遺傳距離的分布發(fā)現(xiàn)：個體間遺傳距離呈正態(tài)分布，與子代生長性狀隨親本遺傳距離增大先升高后下降的趨勢相似；遺傳距離的正態(tài)分布曲線是變動的，個體間遺傳距離的大小不僅取決于群體的遺傳背景，同樣還受到樣本量大小、標記的多態(tài)性、標記類型以及檢測技術的影響。本研究用毛細管凝膠電泳技術對金邊鯉親本群體進行基因型分析，提高了分型的準確性，也會使群體的遺傳多樣性高于垂直版聚丙烯酰胺凝膠技術的分析結果；選取峰值臨近的2個遺傳距離范圍作為繁殖閾值切實可行，一方面可以避免近親交配，另一方面可以最大限度地擴大親本的可選擇性，提高配組效率。

金邊鯉的種源(廣西融水田鯉)組成復雜[3]，加之其選育時間較短，因此群體遺傳多樣性較高，個體間遺傳距離較大。基于遺傳距離的聚類圖也顯示出明顯的呈簇分支，依據(jù)聚類圖劃分的繁殖組間的遺傳分化系數(shù)也達到顯著水平，表明群體來源的復雜性和差異性。選擇不同遺傳距離范圍的親本個體繁殖3個禾花鯉家系進行網(wǎng)箱生長對照實驗，結果來源于不同繁殖組且位于遺傳距離閾值的家系生產(chǎn)性能最佳[27]。據(jù)此，建議金邊鯉家系繁殖配組時，宜從不同繁殖組選擇個體間遺傳距離位于最佳“閾值”0.7～0.9之間的個體作為親本；群體繁殖時，宜繁殖組間雌、雄交叉配組，有助于提高群體的生產(chǎn)性能、保持群體的遺傳多樣性水平。