金 玲，陳奕彬，李色東,5，劉 萍，李 健，呂建建

(1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266235；4.廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東湛江 524022；5.湛江市海洋與漁業(yè)發(fā)展研究中心，廣東湛江 524039)

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)原產(chǎn)于澳大利亞北部，俗稱澳洲淡水龍蝦，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱十足目擬螯蝦科，是世界上最名貴的淡水經(jīng)濟(jì)蝦種之一[1]。它具有個(gè)體大，食性雜，生長(zhǎng)快，病害少，適應(yīng)能力強(qiáng)等養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)。因其可食用部分比率高、肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而廣受歐美等國(guó)家歡迎[2,3]。我國(guó)內(nèi)地最早于1992年廣東珠海進(jìn)行試養(yǎng)，隨后在福建、江蘇、浙江、江西、廣西等地進(jìn)行了小規(guī)模試養(yǎng)，產(chǎn)業(yè)整體處于初級(jí)階段。目前，良種稀缺、親蝦品質(zhì)良莠不齊等因素嚴(yán)重制約了紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[4]。

遺傳多樣性是遺傳選育的基礎(chǔ)[5]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于經(jīng)濟(jì)甲殼類(lèi)物種的不同地理群體遺傳多樣性分析已有不少的報(bào)道，如中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[6]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[7]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)等[8]。開(kāi)展遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析對(duì)于了解紅螯螯蝦種質(zhì)資源現(xiàn)狀、育種潛力及制定育種方案具有重要意義[9]。

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats,SSR)，因其多態(tài)性高、屬于共顯性遺傳、操作便捷等特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析等研究[10-12]。Baker等[13]最早開(kāi)發(fā)了紅螯螯蝦7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。隨后，謝艷楠[14]開(kāi)發(fā)了28個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并對(duì)福建廈門(mén)、廣東廣州、上海崇明3個(gè)不同地理位置的紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。然而，自2011年以來(lái)，我國(guó)紅螯螯蝦群體遺傳多樣性是否發(fā)生改變或降低，亟需提供最新的遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)。

本研究利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)廣東和臺(tái)灣兩個(gè)主要的紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行分析，旨在了解兩個(gè)群體的遺傳多樣性信息和遺傳結(jié)構(gòu)，同時(shí)為后續(xù)的紅螯螯蝦種質(zhì)資源評(píng)估及利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的紅螯螯蝦群體分別來(lái)自廣東和臺(tái)灣。每個(gè)群體30尾，雌雄比為1 ∶1。取背部適量的肌肉樣品共60份，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用TransGen Biotech的基因組DNA提取試劑盒，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)提取紅螯螯蝦DNA，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，微量分光光度計(jì)測(cè)其濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物的篩選與條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)所用引物序列均為之前已報(bào)道的SSR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。利用梯度PCR方法篩選SSR引物并確定其最適退火溫度，最終獲得10對(duì)符合實(shí)驗(yàn)要求的引物(表1)。

1.2.3 PCR反應(yīng)及檢測(cè)

具體實(shí)施步驟如下：由3條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第1條是5′端帶有M13尾的正向引物(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′)；第2條是SSR反向引物；第3條是帶有熒光標(biāo)記的M13 通用引物(5′端用FAM、HEX、ROX熒光基團(tuán)標(biāo)記)。以上所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物準(zhǔn)備就緒后利用篩選出的10個(gè)位點(diǎn)對(duì)60個(gè)紅螯螯蝦基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 3.2μL，M13正向引物(10 μmol/L) 0.4μL，反向引物(10 μmol/L) 1.6 μL，M13熒光引物(10 μmol/L) 1.6 μL，DNA模板小于1 μg，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s；引物在各自退火溫度下復(fù)性30 s；72 ℃延伸1 min；34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠檢測(cè)并觀察其條帶，將符合條件的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用PopGene3.2[15]軟件來(lái)分析等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon指數(shù)(H)等；觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)以及Hardy-Weinberg平衡(P)檢驗(yàn)等遺傳多樣性參數(shù)則利用Cervus 3.0.7軟件完成；用公式D=(Ho-He)/He計(jì)算遺傳偏離系數(shù)(D)[16]；用FSTAT[17]軟件計(jì)算近交系數(shù)(Fis)以及群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)。

2 結(jié)果

2.1 SSR標(biāo)記在兩個(gè)群體中的分型

本研究對(duì)廣東和臺(tái)灣紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行微衛(wèi)星分型(圖1)。10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在2個(gè)養(yǎng)殖群體中共檢測(cè)到83個(gè)等位基因，各個(gè)位點(diǎn)的Na介于3～17之間，其中位點(diǎn)HAo22數(shù)量最多(Na=17)，位點(diǎn)HAo04數(shù)量最少(Na=3)；Ne范圍為1.180～4.699，平均Ne為2.784(表2)。廣東和臺(tái)灣養(yǎng)殖群體在10個(gè)位點(diǎn)上的平均Na均為6；平均Ne分別為2.619和2.829(表3)。

表2 10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳多樣性參數(shù)

表3 2個(gè)紅螯螯蝦群體在10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳多樣性參數(shù)比較

2.2 兩個(gè)群體的遺傳多樣性分析

兩個(gè)紅螯螯蝦群體的平均Ho為0.464，平均He為0.557；PIC介于0.146～0.770之間，平均PIC為0.517，其中位點(diǎn)HAo22最高，位點(diǎn)HAo03最低(表2)。結(jié)果表明10個(gè)位點(diǎn)中6個(gè)位點(diǎn)顯示高度多態(tài)性(PIC>0.50)，2個(gè)位點(diǎn)顯示中度多態(tài)性(0.25

表4 2個(gè)紅螯螯蝦群體10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性指數(shù)及近交系數(shù)

2.3 群體間的遺傳分化及近交系數(shù)評(píng)估

對(duì)紅螯螯蝦2個(gè)群體的遺傳分化指數(shù)Fst值進(jìn)行分析，廣東群體和臺(tái)灣群體間的Fst為0.0969，屬于中等程度的分化(0.05

3 討論

遺傳多樣性分析結(jié)果表明，廣東群體平均PIC為0.465，呈中度多態(tài)性，而臺(tái)灣群體的平均PIC為0.517，呈高度多態(tài)性。整體而言，國(guó)內(nèi)兩個(gè)群體的遺傳多樣性水平較高。謝雁南等[14]利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)廈門(mén)、廣州、崇明3個(gè)紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示三個(gè)群體的平均PIC為0.451 ～ 0.480。該結(jié)果與本研究結(jié)果相似，表明經(jīng)過(guò)近十年的累代養(yǎng)殖，國(guó)內(nèi)紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體仍保持在較高的遺傳多樣性水平。然而，相較Baker等[18]已報(bào)道的澳大利亞野生種群，國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平確有一定程度的下降，說(shuō)明在今后的選育或保種過(guò)程中，仍需制定科學(xué)、合理的方案，以維持較高的群體多樣性水平。

Shannon指數(shù)H是判定遺傳多樣性水平的重要指標(biāo)[19]，根據(jù)Shannon多樣性指數(shù)，廣東群體和臺(tái)灣群體分別為1.069、1.192，進(jìn)一步說(shuō)明兩群體的遺傳多樣性較為豐富。Fst是反映群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。本研究中，紅螯螯蝦群體間的Fst值為0.0969，為中等程度遺傳分化(0.05

本研究通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)廣東和臺(tái)灣紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行分析，得到其群體間的遺傳多樣性等信息。研究結(jié)果為紅螯螯蝦的遺傳多樣性評(píng)估、遺傳選育提供數(shù)據(jù)參考，有助于推動(dòng)紅螯螯蝦種質(zhì)資源的合理保護(hù)與利用。