楊衛(wèi)民，杜京旗，路文靜

（呂梁學(xué)院，呂梁林果植物化學(xué)省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西呂梁033001）

核桃（Juglans regia L）.又稱胡桃，羌桃，為胡桃科植物。核桃青皮、花、葉中均含有一定量的不同種類的生物堿成分。作為一類來源于生物界的含氮有機物質(zhì)，大部分生物堿分子的結(jié)構(gòu)特性一般較為復(fù)雜，多具有顯著的生理藥理效應(yīng)，呈現(xiàn)不同程度的堿性，是中草藥的重要有效成分。一些生物堿由于在生物制藥和衛(wèi)生等方面具有很強的實用性潛能和開發(fā)市場，正逐漸成為人們研究熱點，具有抗腫瘤、抗病毒、消炎等醫(yī)學(xué)方面的作用。

吳茱萸堿結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 吳茱萸堿結(jié)構(gòu)式

吲哚類生物堿是具有吲哚分子骨架的一類化合物，具有多種良好的生理活性。目前，吲哚類生物堿的研究成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點之一，特別是在新藥及其新藥先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中具有不可替代的作用[1-3]。吲哚類生物堿抗腫瘤機制一般可分為2類，一類是直接殺傷腫瘤細胞，另一類是干擾細胞周期的有絲分裂階段，抑制腫瘤細胞的分裂和增殖。此外，吲哚類生物堿抗腫瘤成分在誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞凋亡和提高機體免疫力方面也表現(xiàn)出一定的作用。核桃青皮等是一種具有前景的抗腫瘤新藥[4]。

核桃青皮、花、葉內(nèi)均富含多種生物活性物質(zhì)，關(guān)于青皮中有效化學(xué)成分的提取已被報道[4]。然而，目前生物堿的獲取途徑仍然比較單一，生物堿中的許多種類還沒有得到深層次的研發(fā)。從當(dāng)前的研究發(fā)展來看，局限性主要表現(xiàn)為某些分離技術(shù)的不成熟，比如較高的純化成本、較低的分離產(chǎn)量等問題，尤其是大部分分離純化技術(shù)尚處在實驗室研究階段。試驗以核桃不同部位為原料，75%的甲醇為提取劑，經(jīng)微波超聲波組合萃取儀輔助處理，用薄層層析分離純化獲得三萜類化合物，用TLC-CMS技術(shù)對其進行了檢測與表征，該技術(shù)可直接從TLC薄層板上獲取質(zhì)譜圖，其優(yōu)點是不經(jīng)過樣品前處理，可快速從復(fù)雜混合物中獲得目標(biāo)物分子質(zhì)量信息，并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及主要儀器

材料：核桃青皮、葉、枝條，均采集于呂梁。

試劑：甲醇、石油醚、氯仿、苯、冰乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、環(huán)己烷等，均為分析純；色譜甲醇；薄層硅膠板色譜分析板；吳茱萸堿（CAS：518-17-2；純度＞99%），購買于中檢所。

儀器：ALB-224型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；XH-300B型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KH-3000Plus型薄層色譜儀，上?？普苌萍加邢薰井a(chǎn)品；Expressions型質(zhì)譜儀、Plate ExpressTLC-質(zhì)譜接口，美國Advion公司產(chǎn)品；Tensor-11型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法與步驟

1.2.1 總生物堿的粗提取

核桃青皮陰干、粉碎、過80目篩，稱取7.2 g核桃青皮粉，以料液比1∶30加75%甲醇溶液，恒溫振蕩24 h，溫度45℃。

超聲波微波組合萃取儀分3個階段提取，每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，分別設(shè)置溫度為40，45，50℃；超聲波功率為850，900，800 W；微波功率為100，200，300 W；超聲波頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉(zhuǎn)速900 r/min。

提取液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，3次，合并上清液，上清液用0.45 μm微膜減壓過濾，于水浴溫度為65℃下濃縮至體積的1/4。

等量石油醚除雜3次，用鹽酸酸化至pH值2～3時，等量氯仿萃取3次。用氫氧化鈉堿化至pH值9～10時，用等量的氯仿∶甲醇溶液（3∶1，V/V）混合液體萃取3次，獲取氯仿甲醇相后。濃縮至固體狀，用色譜甲醇定容至10 mL。

核桃葉和枝處理方法與上述相同。

1.2.2 樣液中吳茱萸堿含量檢測

配制0.010 000，0.005 000，0.002 500，0.001 250，0.000 625 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的吳茱萸堿甲醇溶液，在最大吸收峰下測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別檢測新鮮核桃青皮和葉、陳葉、枝提取液的吸光度，計算其含量。

1.2.3 薄層色譜分離純化

用微量進樣器吸取25 μL吲哚類生物堿對照品溶液，置于全自動點樣機上，設(shè)置點樣參數(shù)（點樣間距10 mm，點樣寬度8 mm，點樣數(shù)目4，點樣量分別為2，4，6，點樣速度5 s/μL），在聚酰胺薄膜上進行點樣；再吸取25 μL供試品溶液，點樣20 μL。

配制甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚展開劑，倒入展開缸后蓋等待20 min，將點樣完成的硅膠板輕輕放入展開劑液面高2～3 mm的平臥式展開缸內(nèi)，待到展開劑前沿距離硅膠板頂端約1 cm處時，取出晾干。將晾干的層析板放入薄層色譜成像系統(tǒng)，在365 nm的紫外光燈下觀察層析情況，并拍照記錄[5-6]。

1.2.4 紅外光譜儀檢測

將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，在測量每一個樣品之前，都需要測量單通道背景光譜，然后將樣品用毛細管點樣至光學(xué)臺的金剛石上，再進行單通道樣品光譜的測量。每一個樣品測量后，都需要進行譜圖處理，如進行氣氛補償，可消除CO2、H2O的干擾。然后將檢測出來的光譜轉(zhuǎn)換成倒峰，選擇單峰檢索標(biāo)出每一個特征峰，保存并進行分析[7-9]。

1.2.5 質(zhì)譜儀檢測

標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜檢測：用色譜甲醇和超純水作為流動相。將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，用微量進樣器吸取10 μL的吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液插入到進樣口處，打到load檔開始進樣，進完樣后打回到inject檔。點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

待測液的質(zhì)譜檢測：流動相與測標(biāo)準(zhǔn)品的流動相相同。使儀器和軟件處于工作狀態(tài)，將待測品薄層板置于TLC-質(zhì)譜接口上，使激光對準(zhǔn)圈出的吳茱萸堿斑點中心處[10]。用軟件操作進行取樣，點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

1.2.6 樣液比旋光度和熔點檢測

通過對TLC的圖譜色譜的分析，判定所分離的物質(zhì)是有效分離，將分離物放入旋光儀中先用甲醇進行校正，然后將溶液倒入，調(diào)節(jié)模式，測定其旋光度和比旋光度，記錄數(shù)值及其平均值。

將提取的樣液放入蒸發(fā)皿中，在電熱板上蒸發(fā)結(jié)晶成為固體，然后將固體放入一端封口的毛細管中，插入熔點儀中，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)碾妷簛砩郎?，?dāng)固體變?yōu)楣桃浩胶獾臓顟B(tài)時，溫度計上顯示的溫度即為該物質(zhì)的熔點[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 吲哚類生物堿的粗提取

吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜圖見圖2，吳茱萸堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖2 吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜圖

圖3 吳茱萸堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可以看出，吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品于波長200～700 nm時進行光譜波峰掃描，于波長224 nm處有最大吸收波峰。

由圖3可以看出，吳茱萸堿在最大吸收波峰下的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Y=154.72X+0.005 5，相關(guān)系數(shù)為0.992 5，線性關(guān)系良好。

核桃供試樣品中總生物堿的提取率和吳茱萸堿含量見表1。

表1 核桃供試樣品中總生物堿的提取率和吳茱萸堿含量

由表1可以看出，無論總生物堿的提取率還是吳茱萸堿的含量，核桃青皮中為最高，新鮮葉其次，枝條和陳葉中為最低[13]。

2.2 薄層色譜分離與分析

核桃青皮樣液TLC成像圖見圖4，核桃新鮮葉樣液TLC成像圖見圖5，核桃陳葉樣液TLC成像圖見圖6，核桃嫩枝樣液TLC成像圖見圖7。

圖4 核桃青皮樣液TLC成像圖

圖5 核桃新鮮葉樣液TLC成像圖

圖6 核桃陳葉樣液TLC成像圖

圖7 核桃嫩枝樣液TLC成像圖

由圖4～圖7可以看出，在不同配比的展開劑下，核桃青皮和新鮮葉樣液色譜斑點較多，展開效果良好，色譜斑點清晰。核桃陳葉和枝條樣液色譜斑點較少，展開效果一般，陳葉樣液色譜斑點有拖尾現(xiàn)象[14-16]。

該檢測結(jié)果與紫外分析結(jié)果一致。

核桃青皮樣液與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品TLC成像圖見圖8，新鮮核桃葉與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品TLC成像圖見圖9。

圖8 核桃青皮樣液與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品TLC成像圖

圖9 新鮮核桃葉與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品TLC成像圖

核桃青皮等4種原料提取液所選用的4種展開劑是經(jīng)過優(yōu)化試驗條件確定的。由于核桃各部分所含化學(xué)成分不同，選取的原料在儲存上也有較大差異，因此選擇了不同的展開劑。

經(jīng)過對核桃青皮等提取液的光譜掃描，以及與吳茱萸堿光譜波峰比對，可初步確定提取的樣品中含有吲哚類生物堿。但是，核桃青皮等提取液到底含有哪一種生物堿，需要對其與標(biāo)準(zhǔn)品進行比對，若有大致相同Rf值的物質(zhì)出現(xiàn)，即可進一步確定所提取的物質(zhì)是吲哚類生物堿[17]。

由圖8可以看出，用甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚（2∶16∶2∶5，V/V）作為展開劑，核桃青皮樣品與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品在同一硅膠板上展開，晾干后在紫外光下觀察拍攝。結(jié)果顯示，核桃青皮樣品展開后色譜斑點很多，標(biāo)記斑點A、B和C，其中斑點A吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值基本一致，且非常清晰?？沙醪酱_定所提取的樣品中含有吳茱萸堿，以及與吳茱萸堿極性相近的其他生物堿類化合物[18-19]。

由圖9可以看出，在展開劑為甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚（1∶9∶2∶5，V/V）下，出現(xiàn)較為明顯的色譜斑點3個，其中斑點A與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品展開位置基本相同，Rf值也大致相同。斑點B和C與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品位置鄰近，可能是極性相近的生物堿。

2.3 質(zhì)譜檢測結(jié)果與分析

吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖見圖10，色譜斑點A質(zhì)譜圖見圖11。

圖10 吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖

圖11 色譜斑點A質(zhì)譜圖

通過查閱相關(guān)文獻[20]可以得知，分子離子峰的識別首先是該離子峰范圍內(nèi)最大的峰值（m/z），其次需要判斷該物質(zhì)是否符合氮規(guī)劃，不含N或含偶數(shù)N的有機分子，其分子離子峰的m/z（即分子量）為偶數(shù)。含奇數(shù)N的有機分子，其分子離子峰的m/z（即分子量）為奇數(shù)，這兩點是識別離子峰的關(guān)鍵。

吳茱萸堿分子式為C19H17N3O，分子量為303，含3個氮原子，其分子離子峰m/z 303左右，為奇數(shù)。

由圖11可以看出，色譜斑點A的分子離子峰為m/z 305.3，其分子離子峰滿足氮規(guī)則。分子離子峰與較小的碎片離子峰產(chǎn)生了合理的碎片丟失（Δm），Δm=305.3-304.4≈1，表示在電子轟擊下打掉了1個H，因此為合理丟失。

色譜斑點B質(zhì)譜圖見圖12。

圖12 色譜斑點B質(zhì)譜圖

由圖12可以看出，色譜斑點B的質(zhì)荷比（m/z）在360以上，而吳茱萸堿的相對分子質(zhì)量為303，色譜斑點B不是吳茱萸堿，可能為其他吲哚類化合物。

色譜斑點C質(zhì)譜圖見圖13。

圖13 色譜斑點C質(zhì)譜圖

由圖13可以看出，色譜斑點C與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖有相近的分子離子峰（304.2，332.1，333.2），故推測斑點C與吳茱萸堿可能有相似的分子組成，具體結(jié)構(gòu)有待進一步分析。

2.4 紅外檢測結(jié)果與分析

吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖（甲醇，第一次）見圖14，吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖（甲醇，第二次）見圖15。

圖14 吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖（甲醇，第一次）

圖15 吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖（甲醇，第二次）

由圖14和圖15可以看出，吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品（甲醇）2次紅外檢測的結(jié)果大致一致，但存在差異（1 650 cm-1和1 669 cm-1，1 449 cm-1和1 448 cm-1，1 411 cm-1和1 392 cm-1，1 113 cm-1和1 112 cm-1，1 019 cm-1和1 017 cm-）1，可視為試驗誤差。

吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖（氯仿）見圖16。

圖16 吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖（氯仿）

由圖16可以看出，吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品（氯仿）和甲醇溶的吳茱萸堿，兩者共同的峰值為吳茱萸堿的特征峰。（2 945 cm-1和2 918 cm-1，2 833 cm-1和2 850 cm-1，1 650 cm-1和1 638 cm-1，1 449 cm-1和1 479 cm-1，1 411 cm-1和1 424 cm-1，1 281 cm-1和1 269 cm-）1。

色譜斑點A的紅外光譜圖（甲醇）見圖17，色譜斑點B的紅外光譜圖（甲醇）見圖18。

圖17 色譜斑點A的紅外光譜圖（甲醇）

圖18 色譜斑點B的紅外光譜圖（甲醇）

由圖17可以看出，色譜斑點A在3 280 cm-1處出現(xiàn)了N-H的伸縮振動吸收峰，在1 654 cm-1處出現(xiàn)了C=O的特征吸收峰，在2 944 cm-1和2 832 cm-1處的吸收峰可以分別為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰，在1 654，1 449，1 414，1 021 cm-1的吸收峰為苯環(huán)的特征吸收峰。這些光譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)一致，也與文獻報道[20]的大致一致，說明為吳茱萸堿。

由圖18可以看出，色譜斑點B與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品有相似之處。在2 943 cm-1和2 832 cm-1處的吸收峰可以分別歸屬為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰，在1 449，1 415，1 115，1 022 cm-1的吸收峰為苯環(huán)的特征吸收峰，這與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品有相似之處。但不完全相同，在2 318 cm-1處的峰可能為甲醇中的羥基峰，在1 654 cm-1左右沒有出現(xiàn)的C=O的特征吸收峰。故推測斑點2可能為吲哚類其他物質(zhì)。

色譜斑點C紅外光譜圖（甲醇）見圖19。

圖19 色譜斑點C紅外光譜圖（甲醇）

由圖19可以看出，色譜斑點C與斑點B的紅外光譜圖相似，同樣有歸屬為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰（2 943 cm-1和2 832 cm-）1，在1 449，1 415，1 115，1 022 cm-1的苯環(huán)的特征吸收峰。沒有在1 654 cm-1左右出現(xiàn)的C=O的特征吸收峰。所以，推測斑點3可能為吲哚類其他物質(zhì)，也可能為別的生物堿化合物。

2.5 比旋光度和熔點檢測與分析

譜斑點的旋光度及比旋光度見表2，色譜斑點及吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的熔點見表3。

表2 色譜斑點的旋光度及比旋光度

表3 色譜斑點及吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的熔點

3 結(jié)論

按料液比1∶30（m/V）加75%甲醇溶液，于超聲波微波組合萃取儀中分3個階段處理。每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，分別設(shè)置溫度為40，45，50℃；超聲波功率為850，900，800 W；微波功率為100，200，300 W；超聲波頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉(zhuǎn)速900 r/min。新鮮核桃青皮、葉和枝中的吳茱萸堿含量依次是50.13，16.67，8.06 mg/100 g。新鮮核桃青皮和葉中所含物質(zhì)種類較多，枝和陳葉中物質(zhì)單一。試驗過程中發(fā)現(xiàn)舊葉中幾乎全是紅色物質(zhì)，而新葉中物質(zhì)比較豐富，枝中物質(zhì)較少。舊葉和新葉的不同，可能是舊葉被氧化的緣故。

在甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚展開劑配比為2∶16∶2∶5（V/V）；1∶9∶2∶5（V/V）；1∶8∶2∶6（V/V）和1∶8∶2∶6（V/V）下，核桃青皮、新葉、舊葉和枝條樣品展開效果良好，色譜斑點清晰；供試樣品與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜斑點位置一致。TLC分離、純化技術(shù)能適應(yīng)不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不同特性（如不同極性）的有效成分提供了有利條件。

供試樣品與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品的最大質(zhì)荷比（m/z）為305，有相同的碎片丟失。質(zhì)譜圖中除包含與吳茱萸堿相符的碎片離子峰外，存在其他多個碎片離子峰或者基峰，推測原因有三：其一選擇的離子源不合適，導(dǎo)致打出的碎片雜多；其二在電轟擊過程中，產(chǎn)生了成倍的碎片離子峰；其三分離純化程度不夠，進入質(zhì)譜的樣液尚存在雜質(zhì)。

供試樣品與吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品在3 280 cm-1處有N-H的伸縮振動吸收峰，1 654 cm-1處有C=O的特征吸收峰，2 944 cm-1和2 832 cm-1處分別歸屬為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰，1 654，1 449，1 414，1 021 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的特征吸收峰；與吳茱萸堿Rf值相近的未知斑點，可能是其他吲哚類化合物。紅外圖譜中，洗脫物的特征峰除與對照品一致外，還有其他峰，但峰面積較小，影響較小，分析可能是TLC分離物中還有些許雜質(zhì)，或者是吲哚類化合物中以吳茱萸堿為母核以外的結(jié)構(gòu)，這需要進一步查閱文獻并進行后續(xù)的研究。

薄層層析-質(zhì)譜-紅外（TLC-CMS-IR）在生物活性物質(zhì)分離純化中具有操作簡便、容易掌握、回收率高、重現(xiàn)性好、分離效率高、分離量較大等特點。TLC-CMS-IR聯(lián)用有望在標(biāo)準(zhǔn)品的制備、天然產(chǎn)物化學(xué)成分研究及新藥篩選、評價、分析或質(zhì)控需求等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。