畢雨星 張香美 盧 涵 趙晶晶 魏興芳 盧音音

河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 河北石家莊 050061

發(fā)酵肉制品是以畜禽肉為原料，自然或人工控制腌制的一類肉制品，傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品為自然發(fā)酵，品質(zhì)受氣候、人為操作影響較大，存在的差異性也較大[1]。隨著發(fā)酵劑在生產(chǎn)上的普及，人工接種發(fā)酵已經(jīng)成為傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的一種普遍做法。目前對(duì)制備直投式發(fā)酵劑的研究較多，方法多為噴霧干燥和真空冷凍干燥(簡(jiǎn)稱凍干)，后者以其所具有的適用范圍廣、發(fā)酵粉劑活菌成活率高等優(yōu)點(diǎn)成為使用較多的工藝之一，但其過程不可避免會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞造成損傷，為此，應(yīng)用合適的冷凍干燥保護(hù)劑至關(guān)重要?；诖?，本文主要綜述了凍干保護(hù)劑及其在直投式肉用發(fā)酵劑制備過程中的應(yīng)用。

1 肉類發(fā)酵劑概述

發(fā)酵劑是指含有活的或休眠的微生物，能在發(fā)酵基質(zhì)中進(jìn)行理想新陳代謝活動(dòng)的制劑[2]，在肉制品發(fā)酵過程中，對(duì)提高肉制品的營養(yǎng)、安全、品質(zhì)及風(fēng)味起著關(guān)鍵性作用[3～5]。常用的肉類發(fā)酵劑主要有以下2類：(1)乳酸菌。主要包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬等。其作用主要是促進(jìn)pH值的快速下降，抑制有害微生物產(chǎn)生的不良反應(yīng)，維持產(chǎn)品穩(wěn)定性并延長(zhǎng)貨架期[6，7]。(2)凝固酶陰性球菌。主要包括木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌等，它們?cè)诎l(fā)酵肉制品生產(chǎn)中主要是通過硝酸鹽還原作用來保障肉制品的色澤品質(zhì)，并且其代謝活動(dòng)對(duì)風(fēng)味的形成起著重要作用[8]。人工接種發(fā)酵劑所具有的顯著優(yōu)勢(shì)，使得當(dāng)前研究熱點(diǎn)集中在其功能性上，廣大研究者為優(yōu)良發(fā)酵劑的篩選做了大量的研究工作。Slima[9](2017)等通過研究植物乳桿菌TN8對(duì)牛肉香腸質(zhì)量和安全性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：植物乳桿菌TN8的加入能改善香腸的質(zhì)地和色澤，并且可以控制脂質(zhì)氧化和腸道沙門氏菌及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長(zhǎng)，可以作為一種潛在的益生菌發(fā)酵劑。張香美[10](2018)等篩選的植物乳桿菌b-2具有較好的抑菌能力和抗氧化能力，張香美[11],盧涵(2018)模仿葡萄球菌BP10能起到增強(qiáng)產(chǎn)品香味的作用，混合2種發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵香腸，可提高發(fā)酵香腸質(zhì)量。

雖然發(fā)酵劑得到了廣泛使用，但是在運(yùn)輸以及儲(chǔ)存過程中如何保持較高活菌數(shù)和活力的問題日益凸顯。近年來，直投式發(fā)酵劑以其具有的顯著優(yōu)勢(shì)而成為發(fā)酵技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一[12]。該類發(fā)酵劑發(fā)酵活力強(qiáng)，不需要進(jìn)行重新傳代就可以直接投入生產(chǎn)應(yīng)用，在使用和管理上都更為方便[13]。

2 直投式肉用發(fā)酵劑

現(xiàn)今微生物發(fā)酵研究及其在各行各業(yè)的應(yīng)用越來越多，為保證生產(chǎn)效果的穩(wěn)定，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)制備發(fā)酵菌粉成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一[14]。為確保產(chǎn)品的生產(chǎn)穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品質(zhì)量，直投式發(fā)酵劑在肉制品生產(chǎn)方面的應(yīng)用日漸增多。直投式肉用發(fā)酵劑是指不必進(jìn)行活化等過程，直接投入肉制品生產(chǎn)的一類發(fā)酵劑，能夠解決普通發(fā)酵劑使用時(shí)具有的一系列問題，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝與傳代復(fù)壯次數(shù)。

早在2004年，雙匯公司就開發(fā)出直投式肉制品發(fā)酵劑，研究發(fā)現(xiàn)，該發(fā)酵劑不僅發(fā)酵性能優(yōu)良，且凍干后能夠保持較高的活菌數(shù)，能達(dá)到1010cfu/g，保存時(shí)間也較長(zhǎng)，這打破了我國一直以來對(duì)發(fā)酵劑進(jìn)口的依賴局面，并且使發(fā)酵劑生產(chǎn)趨于專業(yè)化、規(guī)范化和統(tǒng)一化[15]。近年來，研究者對(duì)肉用直投式發(fā)酵劑也做出了大量研究?？妆ＨA[16](2015)等制備了發(fā)酵肉制品直投式發(fā)酵劑并用于生產(chǎn)發(fā)酵肉，研究表明，制得的肉制品具有較為理想的感官評(píng)價(jià)，且能夠縮短發(fā)酵周期，應(yīng)用效果良好，產(chǎn)品品質(zhì)得到了提升。王衛(wèi)[17](2019)等將直投式發(fā)酵劑應(yīng)用于四川傳統(tǒng)風(fēng)羊腿的加工制作中，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵劑顯然有利于游離氨基酸的降解和風(fēng)味物的形成。母雨[18](2019)等制備植物乳桿菌-木糖葡萄球菌直投式復(fù)合發(fā)酵劑并用于火腿發(fā)酵，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定表明它們能改善發(fā)酵火腿的風(fēng)味品質(zhì)。

雖然直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵肉能夠總體上提升肉制品的品質(zhì)，縮短發(fā)酵時(shí)間，但是菌粉凍干存活率低的問題一度成為阻礙肉類發(fā)酵行業(yè)發(fā)展的壁壘。凍干存活率是衡量菌粉發(fā)酵活力的關(guān)鍵指標(biāo)，是體現(xiàn)直投式發(fā)酵劑制備工藝優(yōu)劣的重要因素。王琳[19](2012)等以干酪乳桿菌為研究對(duì)象，進(jìn)行冷凍干燥后細(xì)胞存活率低至5.25%；黃燕燕[20](2018)等在制備植物乳桿菌DMDL9010直投式發(fā)酵劑時(shí)，凍干存活率僅達(dá)到13.38%，這都表明制備工藝需要進(jìn)一步優(yōu)化，以此來提高凍干存活率，從而制備出更加優(yōu)良的直投式發(fā)酵劑。

3 真空冷凍干燥技術(shù)對(duì)細(xì)胞損傷機(jī)理

真空冷凍干燥是一種除去含水物料中水分的干燥方法，是用來干燥熱敏性物質(zhì)和保存物質(zhì)生物活性的一種有效方法，現(xiàn)已成為保存菌體細(xì)胞最方便、最成功的方法。近年來該技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。

真空冷凍干燥主要分成兩步進(jìn)行。首先是樣品預(yù)凍，即將樣品處于低溫下冷凍，之后是通過真空環(huán)境將樣品中的水分升華、解吸，從而達(dá)到去除水分的目的。經(jīng)過低溫和真空環(huán)境處理，產(chǎn)品不易氧化、熱變性，能最大程度上保持產(chǎn)品生物活性[21]。但凍干過程會(huì)造成菌體細(xì)胞死亡，研究表明，細(xì)菌的存活率和發(fā)酵活力下降的主要原因如下：(1)冷凍和干燥會(huì)造成細(xì)胞膜通透性增加，主要與冷凍過程中冰晶的形成和干燥過程中的磷脂雙分子層損傷有關(guān)；(2)細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，磷脂分子從液晶態(tài)向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變的過程會(huì)使得磷脂分子流動(dòng)性下降，從而對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性造成損傷；(3)細(xì)胞酶及相關(guān)蛋白變性，溶質(zhì)的濃縮效應(yīng)及細(xì)胞脫水效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞酶失活，破壞蛋白質(zhì)與水分子、細(xì)胞膜之間的相互作用力，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，喪失生物功能；(4)核糖核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，冷凍干燥過程會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降，造成細(xì)菌生物活性下降[22～24]。

鑒于直投式肉用發(fā)酵劑具備的一系列優(yōu)勢(shì)以及冷凍干燥過程對(duì)菌體細(xì)胞的損傷機(jī)制，加入凍干保護(hù)劑成為當(dāng)前保持菌粉活力的重要方法。保護(hù)劑種類、含量的選擇，以及保護(hù)劑復(fù)配優(yōu)化成為當(dāng)前熱點(diǎn)研究方向。并且菌株不同，使用的保護(hù)劑配方也不盡相同，這給后續(xù)凍干保護(hù)劑的研究帶來了挑戰(zhàn)。

4 冷凍干燥保護(hù)劑

4.1 保護(hù)劑種類

冷凍干燥過程中，加入保護(hù)劑能對(duì)細(xì)胞提供保護(hù)作用，降低細(xì)胞損傷[25]。常見保護(hù)劑種類如表1所示。

表1 常見保護(hù)劑

4.2 保護(hù)劑復(fù)配

由表1可以看出，不同類型的保護(hù)劑作用機(jī)制不同，存在較大差異，且多數(shù)情況下，單一保護(hù)劑保護(hù)機(jī)理較單一，無法達(dá)到最大程度上的保護(hù)效果，所以在冷凍干燥過程中需要選擇不同保護(hù)類型的保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配，通過交叉保護(hù)達(dá)到最佳保護(hù)效果。

近年來，對(duì)于凍干保護(hù)劑的配方優(yōu)化研究越來越多，目前使用較多的保護(hù)劑為脫脂乳粉、海藻糖、甘油、蔗糖、乳糖、谷氨酸鈉等。張菊[27](2020)等通過單因素試驗(yàn)研究低聚木糖對(duì)乳酸菌的凍干保護(hù)效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，5%的低聚木糖的添加僅能使乳酸菌凍干存活率達(dá)到63.7%，之后通過添加脫脂乳粉、海藻糖和甘油，將糖類、蛋白質(zhì)類、醇類保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配，使各類保護(hù)劑優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，發(fā)揮最佳保護(hù)效果，最終可使凍干存活率提升到80%左右。周佳豪[30](2020)等得出了同樣的結(jié)果，對(duì)干酪乳桿菌LZ183E凍干保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化后，結(jié)果顯示海藻糖、低聚木糖、脫脂乳粉和谷氨酸鈉的復(fù)合添加可使菌株存活率高達(dá)(98.236±0.137)%，顯著高于單因素試驗(yàn)單一保護(hù)劑添加時(shí)的凍干存活率。張風(fēng)華[28](2019)等在制備嗜酸乳桿菌直投式發(fā)酵劑時(shí)，使用保護(hù)劑配方：海藻糖3.03g/100mL、甘油9.50g/100mL、谷氨酸鈉3.50g/100mL，該制備工藝可使得凍干存活率達(dá)到81.24%。較高的凍干存活率表明菌粉發(fā)酵活力較好，保護(hù)劑復(fù)配效果優(yōu)良。

綜上所述，單一保護(hù)劑雖能對(duì)菌體凍干過程起到一定的保護(hù)作用，但是通過多種類保護(hù)劑的融合添加，逐步提高菌粉凍干存活率，能夠使保護(hù)作用發(fā)揮出最佳效果，最大程度上起到保護(hù)菌體細(xì)胞免受凍干損傷的作用。

5 展望

隨著發(fā)酵肉制品的廣受青睞，人工接種的普及，與其相關(guān)的研究已經(jīng)成為當(dāng)前發(fā)酵肉行業(yè)的研究熱點(diǎn)。為得到穩(wěn)定、便攜生產(chǎn)且產(chǎn)品質(zhì)量佳的發(fā)酵肉制品，廣大研究者目前多采用真空冷凍干燥技術(shù)將發(fā)酵菌種制成直投式發(fā)酵劑，使生產(chǎn)效益最大化。但冷凍干燥造成菌粉凍干存活率低的問題苛待解決，凍干保護(hù)劑的研究為解決該問題提供了新的研究思路。單一保護(hù)劑的添加并不能使保護(hù)效果最大化，對(duì)保護(hù)劑復(fù)配研究成為提高菌粉凍干存活率的研究熱點(diǎn)。菌株不同會(huì)使得最佳保護(hù)劑配方、冷凍干燥工藝存在較大差異，故而對(duì)保護(hù)劑的復(fù)配研究需要進(jìn)一步探索。