梁建東 ，陳萬浩 ，代永東 ，韓燕峰 ，田維毅 ，梁宗琦

（1．貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2．貴州中醫(yī)藥大學(xué)菌物藥研究中心，貴州 貴陽 550025；3．貴州大學(xué)真菌資源研究所，貴州 貴陽 550025）

蛹蟲草 [Cordyceps militaris(L．)Link]與冬蟲夏草 [Ophiocordyceps sinensis(Berk．)G．H．Sung,J．M．Sung,Hywel－Jones&Spatafora]、蟬花 （Isaria cicadae Miq．）等相比，野外的種群數(shù)量相對較小，不足以提供人們的商品需求。因而，規(guī)?；斯づ囵B(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體成為利用這一資源的重要途徑。我國是世界上首個(gè)利用昆蟲蛹規(guī)模化培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體的國家[1]。自首次規(guī)?；斯づ囵B(yǎng)蛹蟲草成功以來，人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體的方法已有較大的進(jìn)步[2－3]。在人工選育高產(chǎn)、高適應(yīng)性及高蟲草素含量的菌株方面也做了不少研究工作。如通過基因組DNA去甲基化[4]、離子束誘變[5]、藍(lán)光受體CmWC－1介導(dǎo)[6]、復(fù)壯退化菌株[7－8]等研究，已獲得一些遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)、高蟲草素含量的菌株。在培養(yǎng)條件方面，通過控制光照、溫度等條件，子實(shí)體產(chǎn)量亦可得到提高[9-10]。此外，固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵研究表明，傳代次數(shù)的增加，發(fā)酵菌絲體中的蟲草素含量有降低趨勢，但子實(shí)體中蟲草素含量較穩(wěn)定[5]，一般含量為0.1%～0.5%[11]。

作為新食品資源，市場上細(xì)柱狀或細(xì)頭狀的子實(shí)體，口感缺乏脆性及蟲草素含量較低的蛹蟲草，已不能滿足消費(fèi)者的新需求。選育具有良好商品形態(tài)（如蘑菇狀或粗壯子實(shí)體）及蟲草素含量較高的生產(chǎn)菌株已成為亟待解決的學(xué)術(shù)及生產(chǎn)問題。

以大米和雞蛋為主要基質(zhì)，通過不同組合篩選，以期誘發(fā)形成蘑菇狀形態(tài)（或粗壯型）及兼顧蟲草素含量較高的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

蛹蟲草菌株C.militaris（編號PM-LNQS），分離自遼寧千山采集的蛹蟲草新鮮標(biāo)本，保存于貴州大學(xué)真菌資源研究所。

1.1.2 試劑

蟲草素對照品購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

分析型高效液相色譜，美國安捷倫1100系列；電子天平JA2003，上海天平儀器廠；超聲波清洗機(jī)SB2200型，必能信超聲（上海）有限公司；其他為一般常規(guī)儀器。

1.1.4 培養(yǎng)基

菌種活化為常規(guī)PDA培養(yǎng)基。蛹蟲草液體母種培養(yǎng)基：蛋白胨2%、蔗糖2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%，水1000mL，pH自然，121℃滅菌30min。

固體栽培培養(yǎng)基：全蛋培養(yǎng)基（CE） 為全雞蛋（去殼）90 g；米飯全蛋培養(yǎng)基（RE）為預(yù)先蒸好的米飯45 g、全雞蛋（去殼） 45 g；蛋黃培養(yǎng)基（CY） 為蛋黃90 g；米飯蛋黃培養(yǎng)基（RY）為預(yù)先蒸好的米飯45 g、蛋黃45 g；米飯培養(yǎng)基（CR）為預(yù)先蒸好的米飯90 g。以上培養(yǎng)基pH自然，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株活化

將所試菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后備用。

1.2.2 種子液的制備

將接有蛹蟲草菌株的PDA斜面培養(yǎng)基在無菌條件下用0.02%吐溫80滅菌水洗孢子，孢子液稀釋至1×106個(gè)/mL后，接種2 mL孢子懸液到液體母種培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶裝液量為 50 mL），在25℃、150 r·min-1條件下，震蕩培養(yǎng)4 d，備用。

1.2.3 接種及培養(yǎng)

取5 mL液體發(fā)酵所得的懸液（菌絲段濃度為1×106個(gè)/mL），接種于滅菌的不同固體栽培培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5瓶，放入人工氣候箱恒溫25℃暗培養(yǎng)，待菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)基時(shí)改為變溫見光培養(yǎng)（白天12 h見光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為400 lx～600 lx，溫度為22℃；晚上暗培養(yǎng)12 h，溫度為15℃）。每日觀察記錄，培養(yǎng)75 d后采收，測量，取樣。

1.2.4 蟲草素和相關(guān)核苷類物質(zhì)含量測定

將子實(shí)體和培養(yǎng)基分別采收，稱重后于42℃烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。稱取干菌粉0.1 g置于具塞試管中，加入雙蒸水10 mL，超聲處理30 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾[12]。

色譜柱為Thermo Scientific Hypersil ODS-2(C18)（150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為 10 mmol·L-1KH2PO4（溶于甲醇） ∶雙蒸水為 8∶92；檢測波長254 nm；柱溫45℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

取樣測定蟲草素和相關(guān)核苷類物質(zhì)含量，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3） 表示。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對子實(shí)體形態(tài)與特性的影響

2.1.1 不同培養(yǎng)基對子實(shí)體形態(tài)的影響

菌株在不同固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。

由圖1所示，在發(fā)菌階段，觀察到全部固態(tài)培養(yǎng)基中的純白色菌絲體生長旺盛，并在7 d～10 d內(nèi)覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基；隨后全蛋培養(yǎng)基、米飯全蛋培養(yǎng)基和蛋黃培養(yǎng)基表面的菌絲開始變?yōu)槌壬?，子?shí)體開始生長。在原基和子實(shí)體生長階段，全蛋培養(yǎng)基原基出現(xiàn)最晚，子實(shí)體生長最快、粗壯、頂部有明顯膨大和出現(xiàn)蘑菇狀的子實(shí)體，蘑菇狀子實(shí)體頂部有明顯的瘤狀突起。米飯全蛋培養(yǎng)基最早出現(xiàn)原基，后可見橙色幼嫩子實(shí)體沿瓶壁生長，逐漸變金黃色指狀子實(shí)體，繼續(xù)發(fā)育產(chǎn)生子囊頭。蛋黃培養(yǎng)基子實(shí)體生長最慢，發(fā)育良好，不光滑、分枝多，大部分子實(shí)體纖細(xì)，未形成子囊頭。米飯蛋黃培養(yǎng)基、米飯培養(yǎng)基菌絲未見明顯轉(zhuǎn)色，未有子實(shí)體長出。

圖1 在不同固體培養(yǎng)基上的子實(shí)體形態(tài)Fig．1 Themorphologyofthefruitingbodiesondifferentsolidmedium

2．1．2 不同培養(yǎng)基對原基形成時(shí)間、子實(shí)體重量和生長速率的影響

將長出子實(shí)體的培養(yǎng)基各取3瓶，稱其鮮重；烘干，再稱其干重，計(jì)算每瓶子實(shí)體的鮮重均值、干重均值和鮮重與干重比值結(jié)果見表1。

由表1可知，當(dāng)培養(yǎng)基為全蛋培養(yǎng)基（CE） 時(shí)子實(shí)體原基出現(xiàn)最遲，但生長最快，子實(shí)體鮮重也最大，為26．34 g。隨著培養(yǎng)基組分的變化，加入大米（RE培養(yǎng)基） 或采用全蛋黃（CY培養(yǎng)基） 時(shí)，子實(shí)體鮮重隨之減少，分別為 22．86 g、12．49 g。不同培養(yǎng)基對蛹蟲草子實(shí)體干重、個(gè)數(shù)影響趨勢與鮮重相同，并且蛋黃培養(yǎng)基的鮮重與干重比值較高。

表1 不同固體培養(yǎng)基上子實(shí)體的培養(yǎng)性狀統(tǒng)計(jì)Tab．1 Cultural characteristics statistics of fruiting bodies on different solid medium

2.2 不同培養(yǎng)基對蟲草素、腺苷、腺嘌呤含量的影響

2．2．1 不同培養(yǎng)基對蟲草素含量的影響

不同培養(yǎng)基對子實(shí)體和培養(yǎng)基中蟲草素含量的影響見圖2。

由圖2可知，蛋黃培養(yǎng)基中子實(shí)體的蟲草素含量最高，為 30 414 μg·g－1，在蛋黃培養(yǎng)基 （CY） 中加入大米后，會(huì)抑制子實(shí)體的形成且基質(zhì)中蟲草素含量較低。而未形成子實(shí)體的米飯培養(yǎng)基中蟲草素含量最高。

圖2 不同固態(tài)培養(yǎng)基對子實(shí)體和基質(zhì)中蟲草素含量的影響Fig．2 Effects of different solid medium on cordycepin content in fruiting bodies and substrates

2．2．2 不同培養(yǎng)基對腺苷含量的影響

腺苷是蟲草素合成的前體物質(zhì)[13]，直接促進(jìn)蟲草素的生物合成，其含量將直接影響基質(zhì)中蟲草素的含量。不同培養(yǎng)基對子實(shí)體和基質(zhì)中腺苷含量的影響見圖3。

圖3 不同固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基對子實(shí)體和基質(zhì)中腺苷含量的影響Fig.3 Effects of different solid medium on adenosine content in fruiting bodies and substrates

由圖3可知，培養(yǎng)基中加入一定量的大米均不利于子實(shí)體中腺苷的積累，且相比于大米培養(yǎng)基（CR），加入全蛋（RE培養(yǎng)基）或蛋黃（RY培養(yǎng)基），腺苷含量均有所提高。該研究結(jié)果與簡利茹等[14]添加雞蛋對腺苷的生產(chǎn)具有緩慢促進(jìn)作用基本吻合。5個(gè)培養(yǎng)基質(zhì)中腺苷含量差異明顯，以全蛋培養(yǎng)基最佳，達(dá)到458.40 μg·g-1，且子實(shí)體中腺苷含量亦最高，達(dá)到 799.10 μg·g-1。

2.2.3 不同培養(yǎng)基對腺嘌呤含量的影響

腺嘌呤是腺苷的前體，間接參與蟲草素生物合成[13]，適量地添加腺嘌呤能顯著提高基質(zhì)中蟲草素的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率[15]，因而檢測腺嘌呤的含量可以反應(yīng)培養(yǎng)基合成蟲草素的潛在能力。不同培養(yǎng)基對子實(shí)體和基質(zhì)中腺嘌呤含量的影響見圖4。

由圖4可知，不含大米的全蛋培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基比含大米的米飯全蛋培養(yǎng)基、米飯蛋黃培養(yǎng)基中的腺嘌呤含量更高。從子實(shí)體及所有基質(zhì)中的腺嘌呤含量看，蛋黃培養(yǎng)基中的子實(shí)體含量最高，達(dá)到70.85 μg·g-1。在含大米培養(yǎng)基中，添加全蛋（RE培養(yǎng)基）時(shí)腺嘌呤的含量減少，而添加蛋黃（RY培養(yǎng)基）時(shí)腺嘌呤含量提高。

圖4 不同固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基對子實(shí)體和基質(zhì)中腺嘌呤含量的影響Fig.4 Effects of different solid medium on the content of adenine in fruiting bodies and substrates

3 結(jié)論與討論

隨著蛹蟲草的功能逐步被認(rèn)可，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)子實(shí)體的培養(yǎng)技術(shù)越來越受關(guān)注[16]，在蛹蟲草人工培養(yǎng)中，菌種制備、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的選擇是關(guān)鍵。液體菌種是規(guī)?；a(chǎn)中的首選菌種，其具有制備時(shí)間短、污染率低、菌種質(zhì)量較高等優(yōu)點(diǎn)。種子液的菌絲段濃度會(huì)直接影響培養(yǎng)能否成功。研究采用濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸液，接種至2 mL到50 mL培養(yǎng)基中，25℃、150 r·min-1震蕩培養(yǎng)4 d時(shí)，菌絲球的大小、數(shù)量及種子液的濃度處于最佳狀態(tài)，接種固體培養(yǎng)基后獲得理想效果。

在我國蛹蟲草人工培養(yǎng)的早期，已有學(xué)者用雞蛋培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體，但長出的子實(shí)體基本是纖細(xì)的柱狀。李輝平和宋金[17]通過對子囊孢子萌發(fā)菌株篩選，得到一株膨大矮化的蛹蟲草菌株，子座直徑達(dá)到8.3 mm。本研究獲得的子實(shí)體整體呈蘑菇狀，這與其結(jié)果明顯不同?，F(xiàn)有研究已表明，真菌個(gè)體發(fā)育的階段轉(zhuǎn)化及形態(tài)建成受多基因調(diào)控，培養(yǎng)基中豐富的氮源有利于營養(yǎng)生長和代謝積累，進(jìn)而也就影響了其向生殖生長的轉(zhuǎn)化[18-20]。所篩選出的含雞蛋培養(yǎng)基配方實(shí)際上促進(jìn)了營養(yǎng)生長階段，而抑制了向有性生殖階段的轉(zhuǎn)化和組織建成，蘑菇狀的子實(shí)體實(shí)為一個(gè)營養(yǎng)體。因此，試驗(yàn)為探索培育蘑菇狀商品形態(tài)的蛹蟲草菌提供了新思路。

蟲草素是蛹蟲草中特有的活性成分，主要存在于子實(shí)體中，是反映子實(shí)體品質(zhì)高低的關(guān)鍵成分。從微生物代謝角度可知，蟲草素合成的直接前體物是腺苷，腺嘌呤、次黃嘌呤等間接參與蟲草素合成[16，21]，故本試驗(yàn)綜合考察蟲草素、腺苷、腺嘌呤的含量以篩選出高品質(zhì)子實(shí)體培養(yǎng)基。全蛋培養(yǎng)基子實(shí)體形態(tài)差異較大，原基分化最遲，但個(gè)數(shù)最多，生長速率最快，顏色較黃、略暗，腺苷含量最高。蛋黃培養(yǎng)基子實(shí)體的外觀性狀最好，但個(gè)數(shù)最少，生長速率最慢，色澤呈鮮亮的桔黃色，蟲草素和腺嘌呤含量最高。米飯培養(yǎng)基未形成子實(shí)體，但其培養(yǎng)基質(zhì)中含蟲草素最多，而其他形成子實(shí)體的培養(yǎng)基中也有蟲草素積累，且含量高低與子實(shí)體中含量的變化并不一致，這說明基質(zhì)中菌絲產(chǎn)蟲草素的能力較強(qiáng)，且與子實(shí)體形成的關(guān)系不大。另外，根據(jù)研究結(jié)果，蟲草素、腺嘌呤、腺苷的含量與蛹蟲草子實(shí)體長勢情況并不直接相關(guān)，單從子實(shí)體的形態(tài)特性來判斷蛹蟲草生長最適培養(yǎng)基具一定的局限性。雖然部分培養(yǎng)基不能出現(xiàn)轉(zhuǎn)色出菇，但仍能測出一定量的腺苷、腺嘌呤及蟲草素，可作為提取蟲草素的原料，為以后開發(fā)不出菇的蛹蟲草固體培養(yǎng)基提供了可參考的線索。