黃顯曄　謝宇庭　張鵬宇

摘要：黑龍江省大慶市某豬場發(fā)生了仔豬腹瀉的情況。為了探究是何種病原微生物造成的仔豬腹瀉，對病死仔豬進行剖檢，并無菌采集剖檢病料進行鏡檢、病原菌分離培養(yǎng)、PCR確定該病原菌攜帶的毒力基因，并進行了藥敏試驗。結(jié)果顯示，引起該豬場仔豬腹瀉的病原菌為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，攜帶F5黏附素菌毛。該株大腸桿菌對頭孢噻呋、頭孢曲松敏感。對恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥。

關(guān)鍵詞：仔豬;腹瀉;大腸桿菌;黏附素;生化實驗;藥敏試驗

中圖分類號：S858.28? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2021）04-0008-02

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌。起初被認為是人類及動物體內(nèi)的常在菌群，但科研人員逐漸發(fā)現(xiàn)，某些血清型的大腸桿菌會引起人及動物的某些疾病。其中，大腸桿菌可以引起仔豬黃痢、仔豬白痢以及水腫病等[1]。致病性大腸桿菌可分為多種，包括腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAggEC）及腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）。一般通過對致病性大腸桿菌進行毒力因子檢測可確定其為何種類型。目前確定致病性大腸桿菌毒力因子的方法主要有黏菌素菌毛、腸毒素以及LEE毒力島素等[2]。確定為何種致病性大腸桿菌后，可通過藥敏試驗篩選高敏感藥物，為治療該病提供幫助。

2020年10月，黑龍江省大慶市某豬場發(fā)生了仔豬腹瀉。從該豬場送檢器官中分離出一株致病性大腸桿菌，用PCR法對該株細菌所含有毒力因子進行了檢測。并對其進行了藥敏試驗，旨在為該豬場治療仔豬腹瀉提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無菌采集來自黑龍江省大慶地區(qū)某豬場死亡仔豬的病料，包括小腸、大腸、肝臟以及脾臟等。

1.1.2 試劑與儀器 伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司;50×TAE，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;革蘭氏染色液，鄭州理利生物工程有限公司;藥敏紙片、生化試驗管，杭州濱和微生物試劑有限公司;Taq Master Mix、DNA Marker，大連Takara公司;Bio-Rad梯度PCR儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.1.3 試驗動物 清潔級昆明雌鼠6只，35日齡，體重20～26 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 取病死仔豬的的小腸、大腸、肝臟以及脾臟接種于麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板上。在37 ℃條件下培養(yǎng)12? h，再挑取形態(tài)特征明顯的單菌落，劃線傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代后挑取單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細菌形態(tài)。

1.2.2 動物致病性試驗 試驗小鼠分為試驗組和對照組，每組3只。小鼠在試驗前適應(yīng)環(huán)境1周。試驗前12 h禁食、禁水。根據(jù)相關(guān)文獻[3]，將分離菌種進行培養(yǎng)，并對試驗組小鼠進行腹腔注射，注射量為1×109 CFU/只。對照組注射無菌生理鹽水。

1.2.3 毒力因子測定 根據(jù)相關(guān)參考文獻[4，5]的引物序列設(shè)計F4、F5以及987P毒力基因引物（表1）。取純培養(yǎng)的細菌菌液1.5 mL，100 ℃水浴15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清為細菌DNA模板進行毒力因子的測定

1.2.4 藥敏試驗 按照CLSI的指導(dǎo)進行藥敏試驗，試驗用藥敏紙片包括頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素等。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與純化

將病死仔豬的器官進行鏡檢，觀察到革蘭氏陰性短桿菌。對分離出來的細菌接種到伊紅美藍及麥康凱培養(yǎng)基上。在伊紅美藍培養(yǎng)基上觀察到帶金屬光澤的菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上觀察到粉色的菌落。結(jié)合生化試驗結(jié)果，確定該菌為大腸桿菌。

2.2 動物致病性試驗

試驗組小鼠在注射后2 h觀察到精神萎靡的現(xiàn)象，4 h開始腹瀉，8 h后全部死亡。對照組小鼠健康，無死亡。對試驗組小鼠進行心血涂片，可以觀察到革蘭氏陰性短桿菌。復(fù)涂于伊紅美藍培養(yǎng)基，觀察到帶金屬光澤的菌落，判定檢測出的大腸桿菌為致病性大腸桿菌。

2.3 毒力基因鑒定

對分離出的致病性大腸桿菌進行毒力基因檢測，從而確定其攜帶的毒力因子。經(jīng)過PCR測定后，發(fā)現(xiàn)該株細菌攜帶F5黏附素菌毛（圖1）。由此確定該株細菌為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

將分離菌株進行藥敏試驗，抑菌環(huán)與CLSI相關(guān)文件進行比對，發(fā)現(xiàn)該株細菌對頭孢噻呋、頭孢曲松敏感。對恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥。

3 小結(jié)與討論

致病性大腸桿菌可以引起多種動物疾病，包括仔豬腹瀉及犢牛腹瀉。其中產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌為常見的菌種。目前較為常見的方式就是通過PCR方法對大腸桿菌進行毒力因子檢測，從而確定為何種類型的致病性大腸桿菌[6]。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌對動物造成疾病的機制與黏附素性菌毛以及腸毒素相關(guān)。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌進入動物機體后，通過黏附素菌毛與特異性受體結(jié)合后釋放腸毒素，導(dǎo)致正常的代謝破壞，從而導(dǎo)致腹瀉[7]。常見的黏附素菌毛包括F4菌毛（又稱為K88菌毛）、F5菌毛（又稱為K99菌毛）、987P菌毛、F17菌毛及F41菌毛等。其中F4、F5及987P菌毛為豬源性產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌常攜帶的菌毛[8]。經(jīng)常檢測這幾種菌毛可為豬源性大腸桿菌進行定型。本次試驗分離得到的致病性大腸桿菌檢測出了F5黏附素菌毛，從而確定為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，了解了其致病機制，為其防治提供了理論依據(jù)。

利用藥敏試驗可以為臨床用藥治療疾病提供依據(jù)。本次藥敏試驗得出該株大腸桿菌對頭孢噻呋、頭孢曲松敏感，對恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥。可以看出該株細菌對頭孢菌素類抗生素敏感，但是對喹諾酮類藥物及四環(huán)素耐藥。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與這兩種藥物在豬場使用多年有關(guān)，這使得細菌的耐藥性增加[9]。并且細菌間耐藥性的傳播也可以通過質(zhì)粒完成，這也使得細菌耐藥性傳播速度加快。在此情況下，豬場可以通過藥敏試驗篩選出對治療有效的藥物，以更好地治療疾病。也可以根據(jù)藥敏試驗結(jié)果進行藥物聯(lián)用治療，以抑制細菌耐藥性的產(chǎn)生[10]。

本試驗從豬場病死仔豬體內(nèi)分離出了致病性大腸桿菌，通過PCR毒力基因檢測及藥敏試驗，確定了該株細菌的分型以及對何種藥物敏感，為治療該細菌引起的仔豬腹瀉提供了技術(shù)支持。

參考文獻：

[1] 石大麗. 廣西部分地區(qū)豬源大腸桿菌分型及耐藥性分析[D]. 南寧： 廣西大學，2019.

[2] 宋美英. 致病性牛源大腸桿菌毒力基因分子流行病學調(diào)查和耐藥突變選擇窗的應(yīng)用[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學，2017.

[3] 張 震，宋美英，只 勇，等. 黑龍江省部分牛場致病性大腸桿菌毒力因子的調(diào)查與分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（2）： 160-166.

[4] ZHANG W，ZHAO M，RUESCH L，et al. Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains recently isolated from young pigs with diarrhea in the US[J]. Veterinary microbiology，2007，123（13）： 145-152.

[5] 陳楠楠，史同瑞，尹珺伊，等. 齊齊哈爾地區(qū)仔豬腹瀉大腸桿菌血清型與毒力基因分析[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2018，30（6）： 23-27.

[6] 余 佳. 豬源大腸桿菌的分離鑒定，毒力基因檢測及敏感藥物篩選[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學，2019.

[7] 任敏敏，徐 娥，申露露，等. 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致使仔豬腹瀉致病機理的研究進展[J]. 浙江畜牧獸醫(yī)，2019，5（1）： 12-17.

[8] 葛晨玲，石大麗，胡 文，等. 廣西豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌毒力因子及多重耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2019，46（3）： 279-289.

[9] 王春江，趙獻軍，趙 寶，等. 陜西省致仔豬腹瀉ETEC的分子流行病學調(diào)查[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2010，38（7）： 21-26.

[10] 劉玲紅. 動物源大腸桿菌的抗藥性及聯(lián)合用藥策略研究[D]. 山東泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學，2018.