孟冬青　李林顯　王金　劉婷婷　于靚　俞漪　劉洋　趙磊　郭敦愛　蔣禎珍　趙渝

摘? 要： 借助CRISPR-HOLMES系統(tǒng)，以市售酸奶作為檢測對象，檢測了其中的嗜酸乳菌含量.結果表明：CRISPR技術可作為一種有效直觀的方法實現(xiàn)對發(fā)酵乳制品中嗜酸乳桿菌的定性檢測.

關鍵詞： 乳制品; 嗜酸乳桿菌; CRISPR; 實時熒光定量PCR

中圖分類號： Q 93.331??? 文獻標志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2021）02-0142-04

Application of CRISPR technology in the detection ofLactobacillus acidophilusin fermented dairy products

MENG Dongqing， LI Linxian， WANG Jin， LIU Tingting， YU Jing， YU Yi，LIU Yang， ZHAO Lei， GUO Dunai， JIANG Zhenzhen， ZHAO Yu^*

（College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract： In this paper，we detectedLactobacillus acidophiluscontent of some commercial brand yoghurts by using CRISPR-HOLMES system.The results showed that the CRISPR technology can be used as an effective and visual method to qualitatively detectLactobacillus acidophilusin fermented dairy products.

Key words： dairy product; Lactobacillus acidophilus; CRISPR; quantitative real-time PCR

0? 引言

CRISPR是眾多細菌和古細菌在進化過程中產(chǎn)生的適應性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)由簇狀的短回文重復序列構成^[1].細菌和古細菌在發(fā)揮其免疫系統(tǒng)時會經(jīng)歷適應階段、表達階段和干擾階段，在受到病毒或噬菌體侵染時，首先將侵染者的基因組片段整合到自身的基因組中，隨后在體內進行復制轉錄，形成crRNAs（CRISPR RNAs），最終形成記憶片段;當再次受到侵染時，針對不同類型的核酸片段，crRNAs將引導對應的Cas蛋白發(fā)揮核酸酶的功能，進而識別入侵者的核酸片段，并進行切割^[2].因此，在CRISPR系統(tǒng)開發(fā)的初期，研究者將其大量應用于生物體的基因編輯和敲除，隨后，基于Cas12a蛋白和Cas12b蛋白的反式切割活性.王金課題組^[3-4]開發(fā)了名為HOLOMOS的核酸檢測系統(tǒng)，當體系中存在Cas蛋白、sgRNA（small guide RNA）以及待檢測的靶核苷酸片段時，sgRNA先與Cas蛋白結合形成二元復合物，當與sgRNA互補的靶標存在時，兩者經(jīng)堿基互補配對相結合，形成Cas蛋白、sgRNA和靶標核酸的三元復合物，由此激活Cas蛋白的反式切割活性.在該檢測體系中，加入single-stranded DNA （ssDNA）熒光探針，完整的ssDNA上存在探針熒光基團和淬滅基團，因此不會發(fā)出熒光;當被Cas蛋白切割后，熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光信號，被熒光定量PCR（qPCR）收集，進而達到定性檢測的目的.

嗜酸乳桿菌是發(fā)酵乳制品中常用的乳酸菌菌種，作為腸道益生菌在維持腸道菌群平衡以及拮抗致病菌方面具有良好的作用^[5].隨著乳酸菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，當今市面上的發(fā)酵乳制品種類越來越多，因此需要一種靈敏高效的手段來檢測發(fā)酵乳制品中的乳酸菌指標.作為新型的核酸檢測技術，CRISPR相對于其他檢測手段具有較為明顯的靈敏度和特異性.本文采用CRISPR技術的HOLOMOS系統(tǒng)對產(chǎn)品中的嗜酸乳桿菌進行檢測，經(jīng)qPCR收集到的熒光值在2×10⁵～3×10⁵之間，與對照組中的熒光信號值相比，有明顯的差異.

1? 材料與方法

1.1 材料

實驗中所用5種標準菌株如表1所示，菌株均由上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院提供.5種市售乳制品自行購買，如表2所示.

1.2 儀器與設備

東勝ETC811 PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），Tanon EPS200電泳儀（上海天能科技有限公司），Tanon1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海甄明科學儀器有限公司），精宏電熱恒溫水浴鍋（上海右一儀器有限公司），Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀（上海昔今實驗儀器有限公司）.

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

標準菌株在37 ℃下過夜培養(yǎng)，8 000 r?min^-1離心1 min，徹底棄去培養(yǎng)基，然后用DNA快速提取試劑盒進行核酸提取.

待測品核酸提取步驟：按照中華人民共和國國家標準GB 4789.35—2016^[6]進行樣品制備，首先吸取25 mL樣品，放入裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，渦旋振蕩混勻，制成1∶10的樣品混合液.取2 mL待測樣品以1 000 r?min^-1離心5 min，棄去沉淀，取1 mL上清，12 000 r?min^-1離心5 min，棄去上清，所得沉淀即菌體，用DNA快速提取試劑盒進行核酸提取.

1.3.2 核酸擴增

在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行比對分析，設計針對乳酸菌擴增的通用引物序列（Primer?F：5'to3' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;Primer?R：5'to3'CTACGGCTACCTTGTTACGA），擴增片段長度為1 529 bp.選擇嗜酸乳桿菌的SPIDR序列設計嗜酸乳桿菌的擴增引物（Spidr?F：5'to3'CGTCGGCTTCATAATTCTTCAG;Spidr?R：5'to3'GGCAACTTGATCGCTTTACTAG），擴增片段長度為279 bp.

PCR擴增條件：1） 嗜酸乳桿菌擴增，95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，退火溫度56 ℃，15 s，延伸溫度72 ℃，15 s，徹底延伸溫度72 ℃，5 min，進行32個循環(huán);2） 乳酸菌擴增，95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，退火溫度56 ℃，15 s，延伸溫度72 ℃，1 min，徹底延伸72 ℃，5 min，進行32個循環(huán).

1.3.3 sgRNA的合成

CRISPR系統(tǒng)中Cas12b蛋白識別的PAM序列為TTN^[7]，以實驗室先前修飾改造構建的PUC18?DNMT1?3質粒為模板DNA，先擴增出轉錄sgRNA的模板DNA，并進行柱回收.然后在37 ℃下過夜進行體外轉錄合成sgRNA，轉錄體系（50 ?L）：10×Transcription Buffer 5 ?L，NTPs（10 mmol?L^-1）10 ?L，T7 RNA Polymerase 4 ?L，RRI 1 ?L，Template DNA 300～500 ng，RNase-free water補足50 ?L.轉錄結束后，用DNaseⅠ消化模板DNA，再使用RNA回收試劑盒進行回收，最后用Nanodrop軟件對回收的RNA定量.

1.3.4 CRISPR反應

CRISPR反應體系（20 ?L）：包括AapCas12b （10 mmol?L^-1） 0.5 ?L，sgRNA （10 mmol?L^-1）1 ?L，ssDNA熒光探針（10 mmol?L^-1） 1 ?L，靶標DNA 1 ?L，10×NEBuffer 3.1 2 ?L，RRI 0.25 ?L，Nuclease-free H₂O補足到 20 ?L.在qPCR儀中進行反應，48 ℃下，每1 min檢測一次信號，至熒光信號飽和即可.

2? 結果與分析

2.1 靶標擴增結果

以從標準菌株以及實際樣品菌株中提取的基因組為模板，進行靶標的擴增，擴增結束后，取4 ?L PCR產(chǎn)物，在質量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳.電泳結束后，在全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)上查看擴增結果，結果如圖1所示.由圖1可知：5種標準菌株和5種從實際樣品中提取出來的核酸片段均擴增出來大小正確的條帶，通過后續(xù)的回收，作為CRISPR反應體系中的待測片段

2.2 qPCR檢測CRISPR反應結果

取核酸物質的量濃度為5 nmol?L^-1的標準菌株和實際樣品進行CRISPR反應，每個待測樣3次重復，加入到CRISPR反應體系中，在48 ℃下，間隔1 min測1次信號值，1 h結束反應.

反應結果如圖2所示，嗜酸乳桿菌的標準菌株以及含嗜酸乳桿菌的樣品隨著反應的進行，熒光值不斷增高，表明Cas蛋白、sgRNA與互補的靶標結合，形成三元復合物后，激活了Cas蛋白的切割活性，反應體系中的ssDNA熒光探針被切割，經(jīng)qPCR儀收集到熒光信號.反之，非嗜酸乳桿菌的標準菌株以及不含嗜酸乳桿菌的樣品中，熒光信號值無變化，表明反應體系中不存在與sgRNA互補的嗜酸乳桿菌核酸片段.該實驗證明：CRISPR技術可對發(fā)酵乳制品中的嗜酸乳桿菌進行定性檢測.

3? 結論

借助CRISPR技術對市售酸奶中添加的乳酸菌菌種進行了檢測.在CRISPR反應體系中，加入針對嗜酸乳桿菌設計的引物以及sgRNA，通過qPCR儀收集熒光信號.實驗結果證明：CRISPR技術可以實現(xiàn)對發(fā)酵乳制品中的微生物檢測，作為新型核酸檢測技術，相對于傳統(tǒng)檢測手段，具有更加靈敏、高效、直觀的優(yōu)點，隨著方法的不斷完善，其有望成為適應現(xiàn)場環(huán)境檢測的手段.

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（責任編輯：顧浩然，包震宇）