于洋杰 謝坤 施海明

(復旦大學附屬華山醫(yī)院心內科，上海 200040)

血脂異常是動脈粥樣硬化性心血管疾病(arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的重要危險因素之一。在眾多血脂指標當中，降低低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)是目前治療動脈粥樣硬化最有效的手段。主要針對LDL-C的調脂藥物包括他汀類藥物、依折麥布和前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)抑制劑，其均已寫入最新的指南并應用于臨床治療中[1]。這些藥物均能在大部分人群中有效地降低LDL-C，并改善ASCVD患者的預后。用于控制LDL-C的新型藥物的研發(fā)也從未停止。2019年的CLEAR Harmony研究(n=2 230)中應用的貝培多酸是一種可降低LDL-C的三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶抑制劑[2]。2020年的ORION-10(n=1 561)和ORION-11(n=1 617)研究中應用的Inclisiran則是一種小干擾RNA，它可抑制PCSK9合成從而發(fā)揮降低LDL-C的作用[3]。然而，對于家族性高膽固醇血癥患者，這些藥物的治療效果并不理想。而近期研究表明，血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein 3，ANGPTL3)的單克隆抗體可顯著降低家族性高膽固醇血癥患者的LDL-C。現(xiàn)圍繞ANGPTL3對血脂和冠心病的影響進行綜述。

1 家族性高膽固醇血癥患者的困境

家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H)是一種常染色體顯性遺傳病。FH患者由于基因突變導致低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)缺陷，其臨床特征主要表現(xiàn)為LDL-C水平升高以及早發(fā)冠狀動脈疾病風險增加[4]。LDLR存在于肝細胞表面，可清除血液內的LDL-C[5]。雜合子FH(HeFH)患者的血液中LDL-C的水平通常會比普通人高1～2倍，其ASCVD風險也會增加3.5～16.0倍[6]。傳統(tǒng)降脂藥物發(fā)揮其降脂作用均在某種程度上需LDLR的參與[7]。由于HeFH患者仍存在一條編碼LDLR的染色體，傳統(tǒng)的降脂藥物對他們仍有一定的效果。然而對于純合子FH(HoFH)患者，其肝細胞表面的LDLR完全缺陷，傳統(tǒng)調脂藥物對于這類患者的效果非常不理想。因此，研發(fā)通過非LDLR途徑降低LDL-C的藥物對于HoFH患者至關重要。

2 ANGPTL3概述

1999年Conklin等[8]最早從人的胎兒肝/脾cDNA庫分離出了ANGPTL3 cDNA。他們發(fā)現(xiàn)ANGPTL3蛋白由460個氨基酸組成，且與血管生成素有類似的結構。Conklin等[8]同時在小鼠體內也找到了由455個氨基酸組成的ANGPTL3蛋白，該蛋白與人的ANGPTL3有76%的氨基酸序列相同。人類ANGPTL3基因定位于1號染色體短臂(1p30.3)，包含7個外顯子。ANGPTL3主要在肝臟表達，人體組織的Northern印記雜交顯示肝臟中有4種ANGPTL3的轉錄產物，大小分別為4.5 Kb、3.0 Kb、2.8 Kb和1.7 Kb，其中1.7 Kb的ANGPTL3 mRNA在人腎臟足細胞中也有微量表達。該研究還發(fā)現(xiàn)，人類ANGPTL3和小鼠ANGPTL3通過可逆地抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)的催化活性，升高血漿甘油三酯(triglyceride，TG)水平，該結構域的過表達也可提高小鼠的血漿TG水平。

2002年Yoshida等[9]在具有肥胖、高血糖和高血脂的KK小鼠中發(fā)現(xiàn)了低血脂表現(xiàn)的KK/San小鼠，并最早提出了ANGPTL3與血脂的相關性。這一亞群小鼠的血漿TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)和游離脂肪酸水平均低于KK小鼠。該研究通過基因測序發(fā)現(xiàn)KK/San小鼠幾乎不表達ANGPTL3。而誘導KK/San小鼠ANGPTL3基因過表達，或靜脈注射純化的ANGPTL3蛋白則會提高小鼠血漿TG、TC和游離脂肪酸的水平，從而證實了ANGPTL3基因是KK/San小鼠低血脂表現(xiàn)的原因。

人群中也存在ANGPTL3基因(OMIM：604774)的天然突變個體，ANGPTL3基因突變會導致家族性低β脂蛋白血癥2型。這是一種以極低的血漿TG、LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平為特征的常染色體隱性遺傳病。Musunuru等[10]對低β脂蛋白血癥家族的兩個成員進行了基因組測序，發(fā)現(xiàn)這兩個患者ANGPTL3基因的第一個外顯子上攜帶無義突變S17X和E129X，且兩人血液中幾乎檢測不到ANGPTL3，進而提出了ANGPTL3基因的功能缺失型突變?yōu)榧易逍缘挺轮鞍籽Y2型的病因。隨后，有研究者觀察并隨訪了數名家族性低β脂蛋白血癥2型患者，發(fā)現(xiàn)他們均長期處于健康狀態(tài)，且未患脂肪肝、嚴重頸動脈硬化或狹窄和肝功能異常等疾病，提示家族性低β脂蛋白血癥2型本身對人體健康無明顯不良影響[11]。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL3可通過抑制脂LPL和內皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)的活性從而調節(jié)TG和HDL-C的水平，而對于LDL-C的調節(jié)機制目前尚不明晰[12]。LPL位于肝外組織的毛細血管內皮細胞表面，能使極低密度脂蛋白和乳糜微粒中攜帶的TG逐步水解并產生甘油和非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)(圖1)[12-13]。ANGPTL3能使具有催化活性的LPL二聚體解離成無活性的LPL單體，從而導致血漿TG水平升高。EL位于血管內皮細胞的表面，可通過水解HDL磷脂降低HDL水平，阻礙膽固醇逆向轉運[14]。ANGPTL3通過抑制EL的活性來升高血漿HDL-C水平。因此ANGPTL3缺失可導致TG和HDL-C水平的降低。ANGPTL3缺失也可導致LDL-C水平降低，但其機制目前尚未研究透徹，目前可明確的是ANGPTL3缺失導致的LDL-C降低與LDLR無關[15]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，同時敲除小鼠的LDLR和EL后，ANGPTL3抑制劑并不能降低LDL-C，因此ANGPTL3抑制劑很可能是通過EL依賴的途徑降低LDL-C[16]。

圖1 ANGPTL3對脂質代謝的影響及降脂治療方法

3 ANGPTL3抑制劑的臨床研究進展

眾所周知，TG和LDL-C的升高均可增加ASCVD的發(fā)病風險。由于ANGPTL3的缺失可導致TG和LDL-C水平的降低，ANGPTL3抑制劑應運而生。目前一共有4種方法針對性地抑制ANGPTL3基因或ANGPTL3蛋白：基因編輯技術、單克隆抗體、反義寡核苷酸和RNA干擾[17]。真正進入臨床研究階段的方法目前僅有兩種——單克隆抗體和反義寡核苷酸。

3.1 基因編輯技術

從基因層面誘導ANGPTL3基因的功能失活的方法被稱為基因編輯技術。2018年Chadwick等[18]利用堿基編輯器3使C57BL/6J小鼠產生ANGPTL3無義突變。他們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，基因編輯組ANGPTL3、TG和TC分別下降了49%、31%和19%，從而證實了在小鼠體內基因編輯技術是靶向抑制ANGPTL3的有效策略，但該技術能否應用于人體目前尚無研究。因此基因編輯技術進入臨床研究階段還有很長的路要走。

3.2 單克隆抗體

Evinacumab是ANGPTL3的單克隆抗體。2015年Gusarova等[19]的研究表明，在血脂正?；虍惓Ｐ∈笾校珽vinacumab能增加LPL活性，并降低血漿TG、LDL-C和HDL-C水平。2017年，Dewey等[20]在高膽固醇血癥小鼠中發(fā)現(xiàn)Evinacumab在顯著降低血漿TG和TC的同時，還能減小動脈粥樣硬化病變面積和壞死物質含量。同年，Evinacumab在對HoFH患者的一期臨床試驗中顯示出了卓著的療效。經過Evinacumab治療4周后，入選的9例HoFH患者LDL-C和TG水平降低了近50%，HDL-C水平降低了40%[21]。2020年Evinacumab的三期臨床研究得到了令人振奮的結果。該研究最終納入了65例HoFH患者，他們均接受了標準的傳統(tǒng)降脂藥物治療，然而其LDL-C基線水平的均值仍為6.6 mmol/L。在此基礎上，經過24周的治療后，Evinacumab組患者(n=43)相較于安慰劑組患者(n=22)LDL-C水平降低49%，TG降低50%，HDL-C降低30%[22]。并且在整個研究過程中，Evinacumab組的患者未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應。

3.3 反義寡核苷酸

ANGPTL3反義寡核苷酸可介導ANGPTL3 mRNA在細胞內的滅活。2017年Graham等[23]的研究表明，在各種高膽固醇血癥小鼠模型中，ANGPTL3反義寡核苷酸可有效降低肝源性ANGPTL3 mRNA的表達和血漿ANGPTL3的濃度，并劑量依賴性地減少了血漿TG、LDL-C和HDL-C水平，延緩小鼠動脈粥樣硬化的進程。2017年，ANGPTL3的反義寡核苷酸的一期臨床研究也得到了令人興奮的結果。經過不同劑量的IONIS-ANGPTL3-LRx治療6周后，患者的LDL-C降低幅度為1.3%～32.9%，TG降低幅度為33.2%～63.1%[23]。而在2020年ANGPTL3反義寡核苷酸的二期臨床研究中，Vupanorsen顯示出了良好的降脂作用。該研究選擇的人群并非HoFH的患者，而是有高TG血癥、2型糖尿病合并脂肪肝的患者。與安慰劑組相比，每四周給予患者80 mg的Vupanorsen可使患者的TG降低44%，LDL-C降低7%，HDL-C降低24%[24]。整個研究過程中，Vupanorsen組的患者同樣未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應。

3.4 RNA干擾

RNA干擾技術可對目標mRNA進行高效和特異的抑制，引導基因的轉錄后沉默。Xu等[25]在多種小鼠模型及人肝癌細胞中利用RNA干擾介導ANGPTL3基因沉默，發(fā)現(xiàn)RNA干擾能降低野生型和肥胖小鼠的血漿TG、HDL-C和LDL-C水平。目前關于ANGPTL3的RNA干擾技術相關研究較少，其作用強度和生物安全性也需更多研究進一步的補充及驗證。

4 ANGPTL3抑制劑可能存在的問題

既往的重大研究，如IMPROVE-IT、FOURIER和DYSSEY OUTCOMES研究，均證實LDL-C的降低導致的ASCVD風險的降低源自LDL-C降低本身[26-28]。所以雖然Evinacumab的三期臨床研究并未對患者的遠期預后進行隨訪，但從LDL-C的降低幅度和降低的絕對值來看，可預測患者遠期的ASCVD風險會大幅降低。但Evinacumab降低LDL-C的同時也會導致HDL-C的水平降低，幅度為30%。HDL-C可從動脈硬化斑塊中轉運走多余的膽固醇，故HDL被認為是“有益的”脂蛋白。到目前為止，大量相關研究也已證實HDL-C的水平與ASCVD患者的預后有明確的相關性[29-30]。因此難免會對HDL-C的降低有所擔心。

除此之外，還需思考另外的問題——Evinacumab能否用于非FH患者？是否能用于他汀類藥物、依折麥布和PCSK9抑制劑治療效果不佳的患者？或是否比傳統(tǒng)藥物的使用優(yōu)先級更高？對于TG的降低幅度，ANGPTL3的單克隆抗體和反義寡核苷酸均表現(xiàn)出了類似的效果。然而Vupanorsen對于LDL-C的降低幅度并沒有Evinacumab那么高，其原因可能是兩個研究所納入的人群不同，基線LDL-C水平不同。這也提示ANGPTL3抑制劑在正常人群中并不能替代傳統(tǒng)的調脂藥物，或并不優(yōu)于傳統(tǒng)調脂藥物。這一系列問題還有待未來研究闡明。

5 結語

ANGPTL3單克隆抗體制劑三期臨床試驗的成功使家族性高膽固醇血癥的患者看到了希望。研究人員也期待ANGPTL3的反義寡核苷酸制劑在未來能獲得良好的臨床效果。當然，關于ANGPTL3還有一系列問題有待未來的研究闡明。首先，目前尚且不清楚ANGPTL3影響LDL-C水平的具體機制；其次，抑制ANGPTL3導致的致動脈粥樣硬化脂蛋白減少的獲益是否能彌補HDL-C降低的影響，長期應用是否真的能降低ASCVD風險；此外，長期使用ANGPTL3抑制劑的安全性尚不明確。相信隨著對ANGPTL3的深入研究，上述問題將逐漸被解開。