楊曉倩 秦莉 張藝文 汪漢

(西南交通大學醫(yī)學院 西南交通大學附屬醫(yī)院 成都市第三人民醫(yī)院心內科，四川 成都 610031)

2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)是一種比嚴重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒傳播性更強的新型β冠狀病毒，其基因序列與SARS具有很高的同源性，且都會導致嚴重的呼吸道疾病[1-2]。2019-nCoV感染的具有獨特的流行病學特征的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)人數(shù)遠超SARS，但病死率比SARS低得多，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力和干咳，少數(shù)患者有咽痛、腹瀉和惡心等癥狀[1-2]。通過對臨床病例報告的分析發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV除感染肺部外，還會對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響，有臨床病例顯示，無心血管系統(tǒng)疾病的COVID-19患者在疾病發(fā)展過程中出現(xiàn)心肌受損[3-4]。有學者認為2019-nCoV可能與SARS-CoV一樣，能與在心血管系統(tǒng)中廣泛表達的血管緊張素轉換酶Ⅱ受體結合直接感染心肌細胞，造成心肌損傷[4]。研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV感染患者體內的Th1和Th2細胞的反應均增強，使體內炎性細胞因子釋放增多，免疫系統(tǒng)激活[4]。不論是病毒直接感染心肌細胞造成的心肌受損，還是由病毒引起的全身性炎癥風暴和免疫系統(tǒng)紊亂造成的心肌受損，都可能引起心肌細胞炎癥反應，繼而誘發(fā)病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)，其主要臨床癥狀為發(fā)熱、惡心、嘔吐、心慌和胸痛等，嚴重者可能發(fā)生休克、心律失常、心力衰竭，甚至猝死，要及早治療[5]。

中國作為中醫(yī)藥大國，對病毒所致疾病的治療有相當豐富的經(jīng)驗。在中醫(yī)看來，此次2019-nCoV所致疫情的重要特征為“濕”邪，故可稱為“濕毒疫”，其病位在肺，但可累及營血，逆?zhèn)餍陌瑲怅巸商?，對于累及心包的重癥患者，應以清熱、化痰、活血、祛瘀和利水等為主要治療方法；并且中醫(yī)對VMC的看法是“以外感肺衛(wèi)之邪，肺溫熱之毒，乘之入心而致病”，瘀和痰既是其病理產(chǎn)物又是致病因素，應祛痰化瘀[6-8]?？鄥⑹嵌箍浦参锟鄥⒌母谂R床上具有清熱燥濕、抗炎消炎、平喘祛痰和利尿利水等作用，對2019-nCoV感染合并VMC(2019-nCoV心肌炎)可能是有益的。并且已有研究證明，苦參成分中的苦參堿和槐定堿對VMC具有抗炎、抗病毒和抗心肌細胞凋亡等作用[9]。為了闡明苦參對2019-nCoV心肌炎的有益作用，現(xiàn)通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法，在分子水平上對其可能的有效成分和作用機制進行全面的研究[10]。

1 材料和方法

1.1 苦參成分和靶點的預測

在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)中對苦參進行檢索，得到苦參的活性成分，再以生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18對活性成分進行篩選，得到候選化合物，并查找候選化合物對應的靶點[11]。在UnitProt數(shù)據(jù)庫中以“人源”為限定標準，將預測靶點的蛋白名轉換成官方基因名，以便于后面的分析。

1.2 2019-nCoV心肌炎的靶點預測

在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別檢索“novel coronavirus”(新型冠狀病毒)和“myocarditis”(心肌炎)，得到2019-nCoV和心肌炎各自的靶點，然后將它們進行取交集，得到共同靶點，即2019-nCoV心肌炎的潛在靶點。

1.3 “藥物-活性成分-疾病-靶點”的網(wǎng)絡構建

利用R軟件中的“VennDiagram”程序包對苦參治療2019-nCoV心肌炎的作用靶點進行預測，再通過預測到的靶點對上述得到的候選化合物進行篩選，得到與靶點相關的化合物。將作用靶點及其相關化合物導入Cytoscape3.7.2軟件中，以藥物、活性成分、疾病和靶點為節(jié)點，節(jié)點之間的連線為邊，構建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選

通過String數(shù)據(jù)庫，對藥物作用于疾病的靶蛋白進行蛋白質相互作用的網(wǎng)絡分析。限定蛋白種類為“Homo sapiens”(人源)，設置最低蛋白互作得分為0.4，其余參數(shù)保持默認設置，以靶蛋白為節(jié)點，節(jié)點之間以邊相連接。將得到的蛋白互作網(wǎng)絡中，各靶蛋白所連接的節(jié)點數(shù)目進行排序，以連接節(jié)點數(shù)目排名前10的靶蛋白作為關鍵靶點。連接節(jié)點越多可認為在該網(wǎng)絡中越關鍵，越有可能是藥物作用于疾病的關鍵藥效靶點。

1.5 基因本體及通路富集分析

利用R軟件中的“clusterProfiler”安裝包，對苦參作用于2019-nCoV心肌炎的作用靶點進行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)代謝通路分析，得到苦參治療2019-nCoV心肌炎可能涉及的生物學功能和通路。GO分析中通過分子功能、生物過程和細胞組分三個模塊對靶點進行注釋，設定閾值為P<0.05，P值大小表示富集顯著性，P值越小，富集越顯著，可認為P<0.05的所有條目是重要生物學功能，并根據(jù)P值大小進行排序，列出顯著富集的前20個生物學功能的基本信息。與GO分析一樣，選取KEGG分析得到的所有P<0.05的通路，用顯著富集的前20條通路，繪制氣泡圖，圖中節(jié)點的大小表示富集在該通路的基因數(shù)目，節(jié)點的顏色表示P值大小，節(jié)點越紅越大說明該通路越重要。

2 結果

2.1 藥物和疾病的相關靶點

將TCMSP中檢索到的活性成分及其相關靶點，經(jīng)篩選、整合和去重后，最終得到活性成分23個，相關靶點177個。將GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到的疾病靶點整合和去重后，得到2019-nCoV相關靶點348個，其中OMIM數(shù)據(jù)庫未單獨收集心肌炎的相關靶點，改成“myocardial”(心肌)后重新檢索，最終得到心肌炎相關靶點987個，二者取交集后，得到共同靶點139個，即2019-nCoV心肌炎的相關靶點。

2.2 “藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡

在R軟件中導入上述得到的苦參相關靶點和2019-nCoV心肌炎相關靶點，運行“VennDiagram”程序包，得到交集靶點34個，即苦參治療2019-nCoV心肌炎的潛在靶點，進一步的篩選確定了苦參發(fā)揮抗2019-nCoV心肌炎的14個主要活性成分(見表 1)。再將這34個靶點及其相關的14個活性成分導入Cytoscape3.7.2軟件，得到“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(見圖1)。其中，黃色節(jié)點代表藥物，紅色節(jié)點代表疾病，藍色節(jié)點代表成分，綠色節(jié)點代表靶點基因，各節(jié)點之間以邊相連。通過這個網(wǎng)絡，可知苦參主要是通過哪些成分以及這些成分是通過調控哪些靶點來產(chǎn)生對2019-nCoV心肌炎的治療作用。

表1 苦參抗2019-nCoV心肌炎的活性成分

圖1 藥物-活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡圖注：黃色節(jié)點：苦參；紅色節(jié)點：2019-nCoV心肌炎；藍色節(jié)點：苦參的有效活性成分；綠色節(jié)點：苦參和2019-nCoV心肌炎的共同靶點。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡及關鍵靶點

在String數(shù)據(jù)庫中對上述得到的34個作用靶點進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，結果(見圖2)，圖中顯示出34個節(jié)點和367條邊。節(jié)點代表靶基因，不同顏色的邊代表不同的相互作用證據(jù)，兩靶點之間的邊越多，越能證明其具有相關性。利用R軟件對各靶點連接的節(jié)點數(shù)目進行排序，得到排名前10的關鍵靶點(見圖3)，其中白介素(IL)-6連接了31個節(jié)點，是連接節(jié)點最多的靶點。各靶點連接節(jié)點越多，可認為其在該網(wǎng)絡中越重要，越有可能是苦參治療2019-nCoV心肌炎的主要藥效靶點。

圖2 作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡圖注：節(jié)點：靶點蛋白；不同顏色的連線代表不同的互作關系的證據(jù)。

圖3 關鍵靶點

2.4 靶點的GO分析和KEGG分析

GO分析結果顯示共富集到63個與作用靶點相關的功能條目，以P值排序，前20個生物學功能見表2。該結果顯示，這些作用靶點主要涉及的生物學功能有細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結合、趨化因子活性、磷酸酶結合、生長因子受體結合和蛋白磷酸酶結合等。由此得出，苦參對2019-nCoV心肌炎的治療作用參與了多種生物學進程。KEGG分析得到P<0.05的通路135條，以P值排序，將前20條通路進行可視化分析結果(見圖4)。該結果表明，苦參治療2019-nCoV心肌炎的相關靶點主要參與IL-17、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Toll樣受體和缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)等信號通路，涉及其他通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、甲型流感通路、恰加斯病(美洲錐蟲病)通路、百日咳通路和結核通路等，這表明苦參可通過不同的代謝通路，相互協(xié)調、相互合作來發(fā)揮治療2019-nCoV心肌炎的作用。

圖4 苦參治療2019-nCoV心肌炎的主要生物學通路(前20條)

表2 苦參治療2019-nCoV心肌炎的主要生物學功能(前20個)

3 討論

COVID-19是感染2019-nCoV所致的主要疾病，屬于呼吸系統(tǒng)疾病。呼吸系統(tǒng)疾病與炎癥反應密切相關，此次2019-nCoV所導致的體內炎癥風暴可能波及心血管系統(tǒng)，造成心肌損傷，繼而導致心肌炎[3]。這與中醫(yī)的整體觀相契合，即人體是一個有機的整體，體內的五臟六腑是相互關聯(lián)和相互影響的，其中心和肺是氣和血相互依存關系的寫照。苦參性寒涼，具有清熱燥濕的作用，對于2019-nCoV的重要特征“濕邪”和2019-nCoV感染所致的“熱證”可能有益；并且苦參的抗炎消炎作用能減輕炎癥反應造成的心肌損傷。

對于中藥成分多、作用機制復雜的特點，本文采用網(wǎng)絡藥理學的研究方法，通過活性成分篩選、作用靶點預測、網(wǎng)絡構建和分析以及作用靶點功能和通路分析等過程，對苦參治療2019-nCoV心肌炎的作用機制進行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，苦參中有14個活性成分可能通過直接或間接的方式作用于靶點發(fā)揮抗2019-nCoV心肌炎的作用，主要有香芹堿、槐定堿、苦參堿、木犀草素和槲皮素等。其中，苦參堿和槐定堿已被證明對VMC有治療作用[9]。進一步分析得到34個作用靶點，推測苦參可能通過作用于這些靶點發(fā)揮作用。最后對作用靶點的功能和信號通路進行富集分析，結果顯示：作用靶點主要涉及的生物學功能有細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結合、趨化因子活性、磷酸酶結合、生長因子受體結合、蛋白磷酸酶結合、G蛋白偶聯(lián)受體結合和TNF受體結合以及TNF受體超家族結合等，分析發(fā)現(xiàn)這些生物學功能主要與炎癥反應以及細胞生長、增殖和凋亡等密切相關。通路富集結果顯示，作用靶點主要參與調控IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路以及各種疾病通路等多種類型的通路，來發(fā)揮治療作用，其中IL-17、TNF、Toll樣受體和HIF-1等信號通路都與炎癥反應密切相關，并且IL-17信號通路還參與了細胞纖維化進程,TNF信號通路和HIF-1信號通路能調控細胞凋亡，推測苦參通過抑制炎癥反應、心肌細胞纖維化和心肌細胞凋亡等來發(fā)揮抗2019-nCoV所致VMC的作用[12-14]?？傊鄥⑹峭ㄟ^多成分、多靶點和多通路的共同作用發(fā)揮抗2019-nCoV心肌炎的作用。

在34個作用靶點中進一步篩選出10個關鍵靶點，分別是IL-6、IL-10、CASP3、CCL2、IL-1B、CXCL8、ICAM-1、IFNG、IL-4和MAPK1。其中除CASP3和MAPK1外，都與炎癥反應密切相關，IL-6和IL-4能介導T細胞和B細胞活化和增殖，在炎癥反應中起重要作用；IL-10能抑制多種細胞因子的合成，從而抑制細胞免疫應答；CCL2和CXCL8是趨化因子，能誘導炎癥反應，CCL2還能誘導其他炎性因子合成，如IL-6；IL-1B是促炎細胞因子，能活化T細胞和B細胞使細胞因子和抗體產(chǎn)生，促進炎癥反應發(fā)生，另外，IL-1B能促進成纖維細胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生，從而促進心肌細胞纖維化；ICAM-1是細胞間黏附分子，是炎癥發(fā)生的重要分子基礎；IFNG是Ⅱ型干擾素(IFN-γ)，具有免疫調節(jié)作用，促進巨噬細胞吞噬抗原、激活自然殺傷細胞和T、B淋巴細胞，增強機體免疫應答，并且IFN-γ還具有抗病毒活性[13，15]。CASP3參與負責凋亡執(zhí)行的胱天蛋白酶的激活級聯(lián)反應，在細胞凋亡過程中起重要作用[16]。MAPK1主要參與細胞信號轉導，是細胞增殖和分化的調節(jié)劑[17]。這些基因的作用揭示了苦參可能通過調控免疫系統(tǒng)，抑制炎癥反應、心肌細胞纖維化和心肌細胞凋亡或直接產(chǎn)生抗病毒作用等來發(fā)揮治療2019-nCoV心肌炎的作用。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡藥理學方法，挖掘了苦參治療2019-nCoV心肌炎可能的活性成分及其相關作用靶點，對作用靶點進行了功能富集分析和通路富集分析，較全面地分析了其可能的作用機制，為臨床上可能發(fā)生的2019-nCoV心肌炎的治療提供了參考依據(jù)。