潘 科, 方仕茂, 劉忠英, 楊 婷, 戴宇樵, 田小強, 楊勝全

(1.貴州省農業(yè)科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；2.沿河土家族自治縣 生態(tài)茶發(fā)展和技術指導中心，貴州 沿河 565300)

古茶樹資源因其稀缺性而具有很高的研究和市場開發(fā)價值[1].貴州省作為茶樹原產地的核心區(qū)域，其古茶樹資源豐富[2].2017年8月3日，貴州省人大常委會審議通過了《貴州省古茶樹保護條例》，條例定義古茶樹是貴州省行政區(qū)域內樹齡達100年以上的原生地天然生長和栽培型茶樹.研究表明，古茶樹的特征代謝物與選育無性系茶樹有一定差異[3-4]，其中，可溶性糖作為貢獻茶葉風味品質的重要特征代謝物之一[5]，直接參與茶湯甜味品質的形成，以及作為美拉德反應基質參與香氣的形成[6-8].但目前對古茶樹可溶性糖的代謝特征尚不清楚.通過加工可改變茶葉的次生代謝物，尤其是多酚類和游離氨基酸類物質的組成與含量，進而影響茶葉的風味品質[9-10]，明確加工對于茶葉中可溶性糖的影響，可進一步增進對茶葉風味品質的認識.然而，目前對于可溶性糖的檢測主要采用液相配備蒸發(fā)光散射檢測器或示差折光檢測器，少數以傳統(tǒng)的比色法進行測定，而這類檢測大都聚焦于總糖含量分析，對茶葉中可溶性糖的具體組分定性定量分析較少[11].氣相色譜—串聯(lián)質譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS)具有較高的靈敏度，能有效地對茶葉中的可溶性糖組分進行分離和定性定量分析[12].基于此，本研究采用GC-MS/MS靶標分析古茶樹不同葉(樹)型中可溶性糖的積累及加工對紅茶可溶性糖含量的影響，同時，結合感官審評分析，以探究可溶性糖類物質對茶湯甜味品質的潛在貢獻.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 古茶樹鮮葉采自貴州省沿河縣，采集時間為2020年4月1—17日.一芽二葉大葉種喬木型古茶樹位于后坪鄉(xiāng)和客田鎮(zhèn)；一芽二葉中小葉種灌木型古茶樹位于塘壩鎮(zhèn)和新景鎮(zhèn).

1.1.2 儀器與試劑 儀器包括7890B-7000D氣相色譜質譜—質譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)、5424R離心機(Eppendorf公司)、MM400 球磨儀(Retsch公司)、AS60/220.R2電子天平(RADWAG公司)、CentriVap冷凍干燥機(LABCONCO公司)、MIX-200多管渦旋振蕩器(上海凈信)、KQ5200E超聲清洗儀(昆山舒美)、DHG-9055A烘箱(上海合恒儀器設備有限公司)、XD-DCY-24Y氮吹儀(上海析達儀器有限公司).

甲醇、異丙醇均為色譜級，購買于Merck公司；三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷，99%)購買于Aladdin公司；甲氧銨鹽(99%)、吡啶(99%)購買于Sigma-Aldrich公司；正己烷(色譜級)購買于CNW公司；10種糖標準品(色譜級)購買于CNW、IsoReag、TCI 3家公司.

1.2 原料處理

取15份古茶樹鮮葉，每份450 g，并均勻分裝成3份，用鋁箔紙包裹，置于液氮中浸沒5 min，隨后轉入干冰中暫存，最終轉置-80℃冰箱保存直至研磨.鮮葉加入液氮研磨，真空冷凍干燥45 h.鮮葉經萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工序加工成紅茶.取13份紅茶，每份250 g，并均勻分裝成3份，用于感官審評和檢測分析.檢測樣品均經過研磨，過40目篩.

1.3 樣品前處理

將冷凍干燥的鮮葉研磨至粉末狀.準確稱取20 mg茶樣粉末，加入甲醇∶異丙醇∶水=3∶3∶2(體積比)的混合液0.5 mL，渦旋3 min，置冰水中超聲30 min，隨后轉至離心機中于4 ℃、14 000 r·min-1離心3 min.吸取50 μL上清液，加入20 μL內標，混勻器混勻后利用氮吹儀進行氮吹，最后將氮吹濃縮液進行冷凍干燥.向收集的冷凍干燥樣品中加入100 μL 15 mg·mL-1甲氧銨鹽與吡啶的混合液，于37 ℃孵育2 h，隨后加入100 μL三氟乙酰胺，再于37 ℃孵育0.5 h，獲得衍生化溶液.將正己烷稀釋衍生液保存于棕色進樣瓶中，用于GC-MS/MS檢測.

1.4 可溶性糖的分離檢測條件

色譜條件：進樣3 μL，1 mL·min-1的氦氣在分流比為3∶1的分流條件下將樣品載入DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行分離.柱溫箱升溫程序：170 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1升至240 ℃，再以5 ℃·min-1升至280 ℃，最后以25 ℃·min-1升至310 ℃，并保持4 min.質譜條件：傳輸線溫度240 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離電壓70 eV.掃描模式為選擇離子監(jiān)測模式.

1.5 可溶性糖的定性定量方法

采用Afilent MassHunter定性定量軟件進行數據處理，以12種糖化合物混合標準溶液作為質控樣本，在儀器分析過程中，每隔 10個檢測分析樣本插入一個質控樣本，通過對同一質控樣本的質譜檢測分析的總離子流色譜圖進行重疊分析，判斷樣品檢測期間儀器的穩(wěn)定性.

1.6 數據處理

采用Excel、SPSS 25和Origin 2017 64Bit軟件實現(xiàn)數據處理和圖表可視化.

2 結果與分析

2.1 檢出的可溶性糖組分及其含量

基于GC-MS/MS實現(xiàn)12種可溶性糖的分離(附件圖Ⅰ，掃OSID碼可見).在古茶樹鮮葉和紅茶中共檢測出10種可溶性糖.其中，3種為二糖，分別是蔗糖、麥芽糖、海藻糖；7種為單糖，分別是D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、D-山梨醇；而乳糖和木糖醇未檢出.表1顯示：在檢測出的可溶性糖中，大葉種和中小葉種鮮葉均以蔗糖含量最高，分別為(35.18±5.36)、(9.77±3.90) mg·g-1，其次為葡萄糖和D-果糖含量，葡萄糖含量分別為(6.77±2.21)、(1.61±0.57) mg·g-1，D-果糖含量分別為(4.45±2.01)、(0.73±0.55) mg·g-1.在紅茶中，大葉種的D-果糖含量最高，為(7.44±1.37) mg·g-1，其次為葡萄糖含量(6.91 mg·g-1±1.24 mg·g-1)；中小葉種的葡萄糖含量最高，為(5.06±0.43) mg·g-1，其次為D-果糖含量(3.90 mg·g-1±0.32 mg·g-1).

表1 鮮葉及其所制紅茶的可溶性糖含量1)Table 1 Soluble sugar content of fresh tea leaves and dried tea leaves

2.2 不同葉型鮮葉可溶性糖含量的差異

在大葉種和中小葉種的鮮葉中均檢測出10種可溶性糖.表1顯示，大葉種鮮葉中單糖、二糖和總糖的含量分別為(12.41±3.91)、(35.49±5.36)、(47.01±7.77) mg·g-1，中小葉種的含量分別為(2.55±1.04)、(10.06±3.94)、(12.61±4.89) mg·g-1，單糖、二糖和總糖的含量在兩種葉型間均存在顯著差異.圖1顯示，在二糖類物質中，大葉種鮮葉的蔗糖含量極顯著大于中小葉種，兩種葉型的麥芽糖和海藻糖含量差異不顯著.在單糖類物質中，大葉種鮮葉的葡萄糖和D-果糖含量最高，分別為(6.77±2.21)、(4.45±2.01) mg·g-1，其次是D-阿拉伯糖含量(0.14 mg·g-1±0.03 mg·g-1)，其中，大葉種鮮葉的D-果糖、葡萄糖和D-阿拉伯糖含量顯著大于中小葉種；中小葉種鮮葉的L-鼠李糖和D-山梨醇含量極顯著大于大葉種；兩種葉型的L-巖藻糖和D-半乳糖含量差異不顯著.

2.3 不同葉型紅茶可溶性糖含量的差異

鮮葉加工成紅茶后，在大葉種和中小葉種的紅茶中均檢測出10種可溶性糖，木糖醇和乳糖未檢出，此結果與鮮葉的檢出結果一致.由表1可知:大葉種和中小葉種紅茶的單糖含量分別為(14.82±2.57)、(9.80±0.76) mg·g-1，分別較鮮葉增加了19.42%、284.31%(P<0.001)；二糖含量分別為(1.38±0.37)、(0.59±0.04) mg·g-1，分別較鮮葉減少了96.11%、94.14%(P<0.001)；總糖含量分別為(16.20±2.46)、(10.39±0.73) mg·g-1，分別較鮮葉減少了65.54%、17.61%.圖2顯示：在大葉種紅茶中，D-果糖、葡萄糖和蔗糖的含量均顯著大于中小葉種，而D-阿拉伯糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、海藻糖和D-半乳糖的含量均小于中小葉種；兩種葉型的L-巖藻糖和麥芽糖含量差異不顯著.

圖1 兩種葉型古茶樹鮮葉可溶性糖含量的差異Fig.1 Differences on soluble sugar content in ancient tea tree fresh leaves with 2 leaf shapes

2.4 加工工藝對茶葉可溶性糖含量的影響

由表1可知，鮮葉加工成紅茶后，兩種葉型紅茶的單糖含量較鮮葉均顯著增加，二糖和總糖含量顯著減少.紅茶感官審評結果(表2)顯示，紅茶茶湯的甜醇味與紅茶的可溶性糖組分、含量相關.推測古茶樹鮮葉經加工后促進二糖水解為單糖，從而增強了紅茶的甜醇滋味特征.已有研究表明：紅茶加工工藝能有效改善茶湯苦澀味，增加鮮甜度[13-14]；不同加工工藝制成的紅茶，其可溶性糖含量存在差異[15]，且這一差異在同一工序不同處理程度也明顯不同[16].上述前人研究結果結合本研究結果可以證實，鮮葉加工成紅茶后，促進二糖水解為單糖，從而增強了茶湯的甜醇口感.需要指出的是，本研究中的單糖或二糖可能為其他多糖的水解產物；其次，多糖的水解產物也可能在熱作用下發(fā)生美拉德反應參與茶香的形成，從而導致單糖含量減少[7].具體的糖代謝或參與茶葉香氣形成的機理還需進一步研究證明.

圖3顯示：鮮葉制成紅茶后，兩種葉型葡萄糖含量的增加程度差異不明顯；D-山梨醇、L-巖藻糖和L-鼠李糖含量在加工前后的變化規(guī)律不一致.可能原因是由于大葉種鮮葉采自喬木型茶樹，單株采樣、地理位置和管護水平(如采摘輪次)等因素影響可溶性糖的積累差異所導致[17]，從而使其含量在樣品間存在較大差異.該差異對表1中大葉種鮮葉和紅茶可溶性糖含量的標準偏差較中小葉種更大做出了合理的解釋.

圖2 兩種葉型古茶樹紅茶可溶性糖含量的差異Fig.2 Differences on soluble sugar content in ancient tea tree dry tea with 2 leaf shapes

表2 紅茶感官審評結果Table 2 Sensory evaluation of dry tea

圖3 加工對古茶樹茶葉可溶性糖含量的影響Fig.3 Effect of processing on soluble sugar content of ancient tea tree

3 討論與結論

3.1 古茶樹的鮮葉質量是茶葉品質形成的基礎

不同葉型鮮葉可溶性糖含量的差異，是影響古茶樹紅茶品質的關鍵.貴州省沿河縣有豐富的古茶樹資源[2,18].本研究的茶樹鮮葉來源于茶種(Camelliasinensisvar.sinensis)和阿薩姆種(Camelliasinensisvar.assamica)，前者為生長較慢、葉片較小，能夠承受寒冷氣候的灌木，后者為生長較快、葉片較大，對寒冷天氣敏感的喬木[19].本研究結果表明：大葉種鮮葉中蔗糖、D-果糖、葡萄糖和總糖的含量均顯著大于中小葉種，這在一定程度上反映了鮮葉品質的差異，同時也體現(xiàn)出不同類型茶樹在光合作用、呼吸作用和抗逆性等方面的不同[20].紅茶感官審評結果表明，大葉種紅茶的甜醇味更突出，這可能與大葉種紅茶單糖含量較多有關.綜上，鮮葉可溶性糖含量的差異是形成紅茶甜醇風味品質的重要因素[21].

3.2 加工工藝是茶葉風味品質形成的關鍵

加工工藝是形成茶葉風味品質的關鍵[9,22].本研究結果表明，鮮葉制成紅茶后，加工促進了二糖(蔗糖)含量減少，單糖(D-果糖、葡萄糖)含量增加，總糖含量減少，這一結果可能與鮮葉經萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工序處理有關.加工過程中的逆境脅迫或熱處理引起多糖向單糖水解的趨勢加劇，促進多糖類物質逐漸水解成分子量更小的二糖或單糖等物質[16,20]；另一方面，部分可溶性糖在熱作用下與氨基酸等物質發(fā)生美拉德反應參與茶香的形成，從而引起可溶性含量減少[6-7].因此，明確加工過程中代謝物的變化規(guī)律，采用合理的加工技術對茶葉中代謝物的保留、產生或降解實現(xiàn)有效調控，進而提升茶葉品質.

本研究基于GC-MS/MS分析喬木型和灌木型鮮葉可溶性糖含量的差異，并分析了加工對可溶性糖含量的影響，從代謝物水平揭示了古茶樹紅茶甜醇滋味的物質基礎，為紅茶加工提供了參考依據.