靖 琳，閆國(guó)良，樓丹飛，汪?；?/p>

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院急診科，上海 200071）

大腸癌為臨床上一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，臨床主要采用手術(shù)切除的方式治療。外泌體（exosomes）在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，腫瘤轉(zhuǎn)移及發(fā)展中有重要意義。與正常細(xì)胞相比，大腸癌腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放更多外泌體，從而在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。外泌體來(lái)源的Wnt3a/5a，可對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生影響。當(dāng)Wnt3a/5a信號(hào)刺激細(xì)胞時(shí)，Wnt蛋白會(huì)與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，從而加快癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，提高癌細(xì)胞的增殖［1］。本研究對(duì)裸鼠人腸癌轉(zhuǎn)移瘤模型進(jìn)行研究，觀察健脾復(fù)方對(duì)β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1等信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，探索健脾復(fù)方對(duì)大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

選用60只SPF級(jí)雄性健康BALB/c裸鼠，體質(zhì)量18～20g，4～6周齡，購(gòu)于上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HCT116/LoVo細(xì)胞株來(lái)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，Wnt3a/5a、β-catenin抗體、CyclinD1均來(lái)自abcam。

1.2 方法

1.2.1 分組

將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、陽(yáng)性對(duì)照組（B組）、健脾復(fù)方低劑量組（C組）、健脾復(fù)方中劑量組（D組）、健脾復(fù)方高劑量組（E組），每組12只。

1.2.2 模型建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116/LoVo細(xì)胞株制為1×107/mL的細(xì)胞懸液，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色液測(cè)定細(xì)胞活性后，取200mL懸液對(duì)B、C、D、E組小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，待腫瘤生長(zhǎng)到100～300mm3，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 健脾復(fù)方干預(yù)

健脾復(fù)方［4］基礎(chǔ)方為黃芪30g，炒白術(shù)15g，半夏10g，藤梨根30g，淫羊藿15g，薏苡仁30g。使用顆粒中藥溶解物（江陰天江藥業(yè)有限公司）。成人使用健脾復(fù)方為1劑130g，相當(dāng)于顆粒中藥13.08g，小鼠灌胃劑量以人臨床等效劑量的5～10倍計(jì)算，人與小鼠的藥物換算系數(shù)為12.33，以人的體質(zhì)量60kg計(jì)算，20g小鼠1天所需總生藥量T=（13.08g/60kg）×12.33×0.02kg×（10）=1.35g/mL。每日給裸鼠灌胃1次，每次0.4mL。連續(xù)給藥2周。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

治療結(jié)束后，立即處死裸鼠，迅速剝離瘤體進(jìn)行檢測(cè)，記錄裸鼠腫瘤發(fā)生率。

1.3.1 Western Blot檢測(cè)

檢測(cè)相關(guān)Wnt信號(hào)通路蛋白，提取各組瘤體組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液混勻，在進(jìn)行加熱至100℃，冷卻后加入PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉進(jìn)行1h封閉，置于4℃一抗中過(guò)夜，于過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗中孵育1h，使用ECL顯色法進(jìn)行顯色，采用Image J對(duì)圖像進(jìn)行分析，重復(fù)分析3次后得到結(jié)果。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

使用無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行24h培養(yǎng)，加入緩沖液進(jìn)行重置，將瘤體細(xì)胞密度調(diào)節(jié)為1～5（106個(gè)/mL）。取0.1mL細(xì)胞懸液于流式細(xì)胞儀試管內(nèi)，按照標(biāo)準(zhǔn)試劑操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)分析3次后得出結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS22.0對(duì)標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示、用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示、用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組裸鼠Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

A組有1只裸鼠、B組有3只裸鼠、C組有2只裸鼠、D組和E組有3只裸鼠分別死于惡病質(zhì)，各組中裸鼠瘤體β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組表達(dá)水平較低，B組表達(dá)水平高于A組，C、D、E組蛋白表達(dá)逐漸趨于正常，與B組相比，D、E組蛋白表達(dá)量低于B組（P＜0.05），如表1所示。

表1 各組裸鼠Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （±s）

表1 各組裸鼠Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （±s）

組別 例 β-catenin MMP-7 C-MYC CyclinD1 A 11 0.81±0.07 0.63±0.18 0.56±0.12 0.42±0.08 B 9 1.55±0.13 1.21±0.15 1.42±0.32 1.11±0.03 C 10 1.27±0.18 1.01±0.19 1.31±0.21 0.98±0.08 D 9 1.02±0.27 0.84±0.16 1.13±0.20 0.72±0.12 E 9 0.84±0.27 0.63±0.29 0.92±0.23 0.56±0.23

2.2 各組裸鼠藥物干預(yù)后瘤體質(zhì)量比較

B、C組裸鼠瘤體質(zhì)量高于其余3組，隨著健脾復(fù)方劑量上升，D、E組質(zhì)量均下降，如表2所示。

表2 各組裸鼠干預(yù)后瘤體質(zhì)量比較 （g，±s）

表2 各組裸鼠干預(yù)后瘤體質(zhì)量比較 （g，±s）

組別 成瘤數(shù) 瘤體質(zhì)量A 0 0 1.48±0.18 C 10 1.16±0.22 D 8 0.79±0.17 B 8 0.42±0.14 E 6

2.3 Wnt3a/5a對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

Western Blot結(jié)果表明，觀察組細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的Wnt3a/5a蛋白表達(dá)及β-catenin蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組Wnt3a/5a蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.01±0.07），觀察組（0.52±0.11），（t=14.556，P=0.000）。熒光酶報(bào)告表明，Wnt3a/5a結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，熒光酶活性降低，表明健脾復(fù)方可直接抑制癌細(xì)胞內(nèi)Wnt3a/5a表達(dá)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，觀察組細(xì)胞侵襲能力低于對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)入Wnt3a/5a可降低細(xì)胞侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另轉(zhuǎn)入Wnt3a/5a后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游蛋白表達(dá)水平明顯降低。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1-Wnt3a、Wnt5a蛋白檢測(cè)電泳圖

圖2-Western Blot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的蛋白表達(dá)

3 討 論

大腸癌如今首選臨床治療方式為手術(shù)切除，但這一般對(duì)早期癌癥較為有效，對(duì)于癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，臨床上主要使用化療、放療等方法。中醫(yī)認(rèn)為大腸癌是內(nèi)因與外因共同作用的結(jié)果，外在因素包括情志不遂、氣滯血瘀等，內(nèi)在因素包括腎氣不足、陰虛濕熱等。治療需調(diào)理陰陽(yáng)、益氣補(bǔ)血，提高患者生活質(zhì)量［3］。

中醫(yī)本無(wú)大腸癌之稱，但古代對(duì)“癌”卻有一定認(rèn)識(shí)，楊士瀛在《遺方論》［4］指出“癌者，毒根深藏，穿孔透里”，內(nèi)因主要為脾胃功能失調(diào)。李東垣《脾胃論》：“元?dú)獬渥惚硎酒⑽笩o(wú)所傷。”“有瘤體必虛，有虛首健脾”，因此可用健脾解毒中藥治療。健脾復(fù)方中白術(shù)健脾燥濕，薏苡仁利水滲濕，薏苡仁、白術(shù)合用可增強(qiáng)脾功能，增化濕之效。黃芪補(bǔ)腎中元?dú)?、健脾益氣，藤梨根清熱利濕、活血化瘀，淫羊藿補(bǔ)肺、補(bǔ)腎、益精血，半夏燥濕化痰，半夏配藤梨根、淫羊藿等可消腫止痛、化瘀散結(jié)［5-6］。諸藥合用，有活血化瘀、健脾和胃之效，標(biāo)本兼治。腫瘤細(xì)胞中有基質(zhì)金屬蛋白酶等相關(guān)蛋白，可與腫瘤相互作用促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。Wnt/β-catenin信號(hào)是細(xì)胞分化、遷移、生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子之一，一旦被激活，就能通過(guò)Wnt調(diào)控進(jìn)行b-catenin的穩(wěn)定積累，對(duì)細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展有重要相關(guān)性。而異常激活的Wnt/β-catenin信號(hào)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且Wnt3a/5a可促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)下游蛋白表達(dá)，使癌細(xì)胞過(guò)度激活［7-8］。D、E組裸鼠腫瘤體積低于B、C組，表明健脾復(fù)方在癌細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖方面，可顯著抑制其增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡，從而控制大腸癌發(fā)展。原因可能是健脾復(fù)方中黃芪、黨參可刺激腎上腺皮質(zhì)激素分泌，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高機(jī)體抗腫瘤能力［9］。同時(shí)，裸鼠Wnt/β-catenin信號(hào)受到顯著抑制，Wnt3a/5a均少于對(duì)照組，表明健脾復(fù)方可抑制大腸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，從而抑制癌細(xì)胞增殖［10］。除此之外，晚期患者體內(nèi)免疫功能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重下降，而健脾復(fù)方內(nèi)的黨參、黃芪、茯苓等可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能，激活T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性，清除體內(nèi)老化細(xì)胞、病原體，促進(jìn)白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2等炎性因子產(chǎn)生，從而提高免疫能力［11］。放療對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞也會(huì)有一定影響，而健脾復(fù)方中黃芪、黨參可提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加化療效果的作用，減輕不良反應(yīng)［12］。研究還得出β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1在健脾復(fù)方高劑量組中表達(dá)水平最低，陽(yáng)性對(duì)照組裸鼠表達(dá)高于健脾復(fù)方組，即β-catenin異常表達(dá)與MMP-7、C-MYC、CyclinD1在大腸癌腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)高表達(dá)有明顯正相關(guān)性（P＜0.05）表明健脾復(fù)方可下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)，對(duì)相關(guān)腫瘤因子進(jìn)行調(diào)整，達(dá)到改善病癥的療效［13］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為調(diào)控大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要通路之一，β-catenin蛋白對(duì)細(xì)胞活化十分重要。癌細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞向局部侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是惡性腫瘤的重要特征之一，表明健脾復(fù)方可有效恢復(fù)機(jī)體內(nèi)平衡，避免癌細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，從而為腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供新思路。李玉山等［14］指出，Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有維持正常胃腸道細(xì)胞及調(diào)控大腸癌癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用。因此，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可作為預(yù)防、治療大腸癌的作用措施，即對(duì)其進(jìn)行調(diào)控來(lái)降解β-catenin蛋白。王雨艷等［15］檢測(cè)卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的變化，結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a可調(diào)控β-catenin的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期蛋白合成，從而改善預(yù)后。李孝瓊等［16］對(duì)Wnt3a進(jìn)行上調(diào)，發(fā)現(xiàn)β-catenin增加，表明Wnt3a/5a可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。研究通過(guò)熒光酶基因?qū)嶒?yàn)及Western Blot檢測(cè)，證明健脾復(fù)方可通過(guò)Wnt3a/5a有效調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行控制。

綜上所述，健脾復(fù)方可通過(guò)Wnt3a/5a對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化進(jìn)行調(diào)控，從而控制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。