史維麗，班立桐，黃亮，楊紅澎，孫寧，王玉，李奕葶，張怡

一株野生古巴栓孔菌生物學特性的研究

史維麗，班立桐通信作者，黃亮，楊紅澎，孫寧，王玉，李奕葶，張怡

（天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院，天津 300392）

采用單因素和正交試驗法，研究野生古巴栓孔菌（）菌絲的最佳培養(yǎng)條件。單因素試驗結(jié)果表明，古巴栓孔菌菌絲的最適碳源、氮源分別為葡萄糖、酵母浸粉，碳源、氮源的最適添加量分別為5 g/L，3 g/L，最適培養(yǎng)溫度為35 ℃，培養(yǎng)基初始pH對古巴栓孔菌菌絲的生長影響不顯著。正交試驗結(jié)果表明，影響古巴栓孔菌菌絲體生長的因素從大到小依次為：碳源＞溫度＞氮源。最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖15 g/L，酵母浸粉3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀 1 g/L，VB10.01 g/L，瓊脂18 g/L，pH自然，36 ℃培養(yǎng)。

古巴栓孔菌；菌絲生長；溫度；碳氮源；正交試驗

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們對美好生活的需求日益廣泛，對綠色生態(tài)食品越來越重視，作為綠色生態(tài)食品之一的藥食用真菌也引起人們的高度關(guān)注。野生藥食用菌是我國重要的生物資源，也是科學研究的重要類群[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，藥用真菌不僅有強身健體、延綿益壽的功效，還具有抗腫瘤、抗癌的作用。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記載了6種靈芝、茯苓、桑耳等12種真菌的形態(tài)和功效[2]。據(jù)統(tǒng)計，全球共有真菌150萬種以上，目前人們知道的真菌僅有7萬種左右，食藥用真菌逾2 000種，現(xiàn)在被馴化并用于商業(yè)栽植的有100多種。因此，野生食用菌資源的利用價值非常高[3-5]。

編碼rDNA序列分析是對未知生物的鑒定或者表型結(jié)果驗證常用的方法[6-8]。筆者在前期采用編碼rDNA序列分析對供試菌株TNCY002進行了鑒定，鑒定出該野生真菌為真菌門（Eumycota），擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymeno- mycetes）非褶菌目（Aphyllophorales），多孔菌科（Polyporaceae），栓菌屬（），古巴栓孔菌（）。鑒定結(jié)果在GenBank上的登錄號是MN068933.1。

野生大型真菌是人類食用和藥用的重要資源，具有豐富的營養(yǎng)成分和顯著的抗癌、抗腫瘤等作用。鄭義[9]、周凌云等[10]研究發(fā)現(xiàn)，東方栓孔菌多糖對小鼠具有降血糖、降血脂和護肝的作用；郝金斌等[11]發(fā)現(xiàn)奶油栓孔菌多糖具有抗氧化和保肝作用。因此，推測古巴栓孔菌多糖可能具有一定的藥用價值。目前，我國大型真菌資源保護工作存在嚴重不足，物種受威脅程度評估近年來才剛剛起步[12]。另外，我國食藥用菌種類繁多，目前人工馴化栽培成功的數(shù)量有限[13]。因此，探究野生大型真菌的生物學特征，對保護我國野生大型真菌種質(zhì)資源具有指導意義。本研究擬通過探究古巴栓孔菌菌絲的生物特征，為開發(fā)古巴栓孔菌多糖的藥用價值及野生食用菌的馴化、開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌種采自福建省廈門市熱帶植物園中的一顆倒伏枯樹上，通過組織分離得到純菌種，將其命名為TNCY002，現(xiàn)保藏在天津農(nóng)學院食用菌研發(fā)中心。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。

固體平板培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀 1，VB10.01，瓊脂18，pH自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基中碳源的篩選

以相同質(zhì)量濃度的蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和羧甲基纖維素鈉代替固體平板培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變。將培養(yǎng)基放至90 mm平板中，冷卻凝固后，將母種接到不同碳源的培養(yǎng)基上，用接種鏟將菌種切成1 mm左右的方塊，菌塊盡量放在平板正中間。每種碳源3次重復，觀察對比菌絲的生長情況，篩選出最佳碳源。

1.3.2 培養(yǎng)基中氮源的篩選

以相同質(zhì)量濃度的酵母浸粉、黃豆粉、硝酸銨和尿素代替固體平板培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他成分不變。接種方法同1.3.1，觀察對比菌絲的生長情況，篩選出最佳氮源。

1.3.3 培養(yǎng)基中碳源添加量的篩選

將1.3.1中篩選出的最佳碳源在固體培養(yǎng)基中的添加量設(shè)為5、10、15、20、25 g/L，其他成分不變。接種方法同1.3.1，觀察對比菌絲的生長情況，篩選碳源的最佳添加量。

1.3.4 培養(yǎng)基中氮源添加量的篩選

將1.3.2中篩選出的最佳氮源在固體培養(yǎng)基中的添加量設(shè)為1、2、3、4、5 g/L，其他成分不變。接種方法同1.3.1，觀察對比菌絲的生長情況，篩選氮源的最佳添加量。

1.3.5 培養(yǎng)基初始pH的篩選

將固體平板培養(yǎng)基初始pH值設(shè)為5、6、7、8、9，觀察對比菌絲在不同pH培養(yǎng)基中的生長情況。

1.3.6 培養(yǎng)溫度的篩選

將接種后的固體平板培養(yǎng)基分別置于20、25、30、35、37、40 ℃的培養(yǎng)箱中，觀察對比菌絲在不同溫度條件下的生長情況。

1.3.7 菌絲形態(tài)及生長速度的測定

用5 mm的打孔器在長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基邊緣打孔，將菌塊接種至不同碳氮源培養(yǎng)基上，在25 ℃避光條件下進行培養(yǎng)，每天定時觀察菌絲的生長狀態(tài)[14-15]，用十字交叉法測量菌絲的半徑，菌落半徑（cm）和生長時間（d）的比值為菌絲的生長速度（cm/d）[16-17]。記錄菌絲體萌發(fā)時間、菌落顏色、生長勢等培養(yǎng)性狀[18-19]。每組重復3次，菌絲長滿時拍照記錄。

1.3.8 正交試驗

選用L9（34）正交試驗設(shè)計表（表1），從單因素試驗中的最佳碳源、氮源和溫度各個因素中篩選出最佳組合，確定培養(yǎng)古巴栓孔菌的最佳配方及培養(yǎng)條件。測定方法同1.3.5，每組試驗重復3次。

表1 正交試驗因素與水平

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件和Excel進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對菌絲形態(tài)及生長速度的影響

古巴栓孔菌在不同碳源培養(yǎng)基上長滿平板后的菌絲形態(tài)指標見表2。以菌絲生長速度為主要指標，菌落疏密度為參照指標，分析不同碳源對菌絲形態(tài)和生長速度的影響。結(jié)果表明，對菌絲生長速度影響從大到小依次為蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉、乳糖。雖然菌絲在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速度最快，但菌絲較稀疏。在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長狀態(tài)較好，生長速度達到0.74 cm/d。綜合考慮，選擇葡萄糖為最佳碳源。

表2 不同碳源培養(yǎng)基上古巴栓孔菌菌絲和菌落生長狀況

注：表中同列不同大寫字母表示差異顯著（＜0.01）；＋＋＋表示菌絲生長勢強；＋＋表示菌絲生長勢較強；＋表示生長勢一般。下同

2.2 氮源對菌絲形態(tài)及生長速度的影響

古巴栓孔菌在不同氮源培養(yǎng)基上長滿平板后的生長狀態(tài)見表3。以菌絲生長速度為主要指標，菌落疏密度為參照指標，分析不同氮源對菌絲形態(tài)及生長速度的影響。結(jié)果表明，對菌絲生長速度的影響從大到小依次為酵母浸粉、硝酸銨、蛋白胨、黃豆粉、尿素，不同氮源間差異極顯著。以酵母浸粉為氮源時，菌絲生長狀態(tài)最好，菌絲生長速度達到0.9 cm/d。

表3 不同氮源培養(yǎng)基上古巴栓孔菌菌絲和菌落生長狀況

注：表中－表示菌絲生長勢較弱。下同

2.3 碳源添加量對菌絲形態(tài)及生長速度的影響

在不同碳源添加量的培養(yǎng)基上，觀察分析古巴栓孔菌菌絲的生長狀況，如表4所示。

表4 碳源添加量對古巴栓孔菌菌絲和菌落生長狀況的影響

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）

由表4可知，當葡萄糖添加量為5～20 g/L時，菌絲均可生長，碳源添加量對菌絲生長影響顯著。葡萄糖添加量為5 g/L時，菌絲生長速度最快，達到1.2 cm/d。雖然葡萄糖添加量較高時，生長速度稍有降低，但菌絲致密、粗狀、潔白，氣生菌絲較多，菌絲活力較強。因此，可將菌絲生長速度、菌落疏密度、生長形態(tài)作為綜合考察參考指標。

2.4 氮源添加量對菌絲形態(tài)及生長速度的影響

在不同氮源添加量的培養(yǎng)基上，以菌絲生長速度為主要指標，菌落疏密度為參照指標，觀察分析古巴栓孔菌菌絲生長狀況，如表5所示。由表5可見，當酵母浸粉添加量在1～3 g/L時，菌絲生長速度較好，碳源添加量對菌絲生長的影響極顯著。酵母浸粉添加量為3 g/L時，菌絲的生長速度最快，達到1.17 cm/d。

表5 氮源添加量對古巴栓孔菌菌絲和菌落生長狀況的影響

2.5 培養(yǎng)基初始pH對古巴栓孔菌菌絲生長狀況的影響

古巴栓孔菌在不同初始pH培養(yǎng)基上長滿平板后的生長狀況見表6。菌絲在初始pH值為5、6、7、8、9培養(yǎng)基上生長速度沒有顯著性差異，說明培養(yǎng)基pH對古巴栓孔菌菌絲生長影響不大。

表6 培養(yǎng)基初始pH對古巴栓孔菌菌絲和菌落生長狀況的影響

2.6 培養(yǎng)溫度對古巴栓孔菌菌絲生長狀況的影響

古巴栓孔菌在不同溫度條件下的生長狀況見表7。以菌絲的生長速度為主要指標，菌落疏密度為參照指標，觀察分析古巴栓孔菌的生長狀況。結(jié)果表明，溫度對菌絲生長速度影響從大到小依次為35、37、30、40、25、20 ℃，各溫度之間差異性極顯著。在35 ℃條件下培養(yǎng)，菌絲生長狀態(tài)最佳，菌絲生長速度達到1.02 cm/d。

表7 不同溫度條件下古巴栓孔菌菌絲和菌落的生長狀況

2.7 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表8，試驗結(jié)果方差分析見表9。由表8可見，每組試驗重復3次。正交試驗極差A＞C＞B，3因素對古巴栓孔菌菌絲生長的影響從大到小依次為葡萄糖、溫度、酵母浸粉。試驗最佳組合為A1B3C3，菌絲生長速度為1.44 cm/d。通過計算值，理論最佳水平組合仍為A1B3C3。

表8 正交試驗結(jié)果直觀分析表

注：1～3表示以菌絲生長速度為指標的對應水平總和平均值；表示各對應水平干重極差

表9 試驗結(jié)果方差分析

注：表中a表示2＝0.796（調(diào)整后2＝0.735）

從表9可以看出，葡萄糖和溫度的顯著性小于0.01，說明葡萄糖對試驗結(jié)果具有極顯著影響。酵母浸粉顯著性小于0.05，說明酵母浸粉對試驗結(jié)果具有顯著影響。A1B3C3為最好的試驗組合。

2.8 正交試驗驗證

為檢驗正交結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性，對A1B3C3組合進行試驗驗證，試驗重復3次。3次測量的菌絲生長速度分別為：1.43，1.44，1.44 cm/d。3次試驗菌絲生長速度的均值為1.43 cm/d，與正交結(jié)果基本一致，試驗在誤差范圍內(nèi)，故可以證明正交試驗結(jié)果具有穩(wěn)定性和可靠性。

3 結(jié)論

不同的多孔菌科類真菌對碳氮源的喜好各不相同，菌落的生長形態(tài)也不盡相同。畢旺華等[20]通過平板培養(yǎng)法對毛栓孔菌的營養(yǎng)條件進行篩選，得出最佳碳源為蔗糖[21-22]，這一結(jié)論與本研究結(jié)果相符。周永斌等[23]篩選出灰樹花的最佳碳源為葡萄糖，菌絲生長速度為0.55 cm/d，此結(jié)果證明菌種不同，葡萄糖對菌絲生長的影響也不同。通過單因素試驗得出，pH對古巴栓孔菌菌絲生長速度的影響不顯著。碳源、氮源以及溫度對其影響較大，最佳碳源、氮源分別為葡萄糖、酵母浸粉，最佳培養(yǎng)溫度為35 ℃。正交試驗結(jié)果顯示，影響菌絲生長速度的因素從大到小依次為葡萄糖、酵母浸粉、溫度。菌絲最快生長速度可達到1.44 cm/d。通過正交試驗得到的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖15 g/L，酵母浸粉3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀 1 g/L，VB10.01 g/L，瓊脂18 g/L，pH自然，36 ℃培養(yǎng)。在此最佳條件下進行驗證試驗，菌絲的生長速度達到1.43 cm/d，在試驗誤差范圍之內(nèi)，驗證結(jié)論與正交試驗結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果對古巴栓孔菌菌種保藏具有指導意義，為菌絲胞內(nèi)多糖[24]的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

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Studies on the biological characteristics of a wild

Shi Weili, Ban LitongCorresponding Author, Huang Liang, Yang Hongpeng, Sun Ning, Wang Yu, Li Yiting, Zhang Yi

（College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In this experiment, a single factor and orthogonal test methods were used to study the optimal culture conditions of a wildhyphae. The single factor test results showed that the optimal carbon source and nitrogen source for the mycelium of Trametes cubensis were glucose and yeast extract powder, and the optimal addition amount of carbon source and nitrogen source were 5 g/L, 3 g/L. The optimum culture temperature was 35 ℃, and the initial pH of the medium had no significant effect on the growth of the hyphae ofOrthogonal test results showed that the order of the effects on the growth of the mycelium ofwas: carbon source＞temperature＞nitrogen source.The results of orthogonal test showed that the optimum medium was glucose 15 g/L, yeast extract 3 g/L, magnesium sulfate 0.5 g/L, monopotassium phosphate 1 g/L, VB10.01 g/L, Agar 18 g/L, natural pH, culture temperature 36 ℃.

; mycelial growth; temperature; carbon and nitrogen sources; orthogonal test

S646

A

1008-5394（2021）02-0031-05

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.006

2020-07-02

天津市蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（ITTVRS2017015）

史維麗（1994—），女，碩士在讀，研究方向為作物栽培學與耕作學。E-mail：975576049@qq.com。

班立桐（1972—），男，教授，學士，主要從事食用菌栽培研究。E-mail：banlitong@126.com。

責任編輯：宗淑萍