巨紅葉， 趙國(guó)望， 韓立柱， 王曉玲， 崔翔， 宋逍， 唐志書(shū)， 宋在鑫

(1. 安康市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心， 陜西 安康 725000； 2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712046)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一種急性呼吸道傳染病，具有發(fā)病迅速、傳播廣泛、傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力、呼吸困難、呼吸窘迫綜合征等[1]。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委、國(guó)家中醫(yī)藥管理局《關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》，中醫(yī)辨證中的疫毒閉肺證所用的處方為麻杏宣白承清肺湯加減[2]。我院專(zhuān)家根據(jù)安康地區(qū)COVID-19的中醫(yī)證候分布特點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上增加浙貝母、魚(yú)腥草和金銀花，發(fā)揮清肺解毒的作用，將其命名為宣白清肺解毒湯。宣白清肺解毒湯綜合了麻杏仁甘石湯、宣白承氣湯、達(dá)原飲三方化裁而成，包括麻黃、魚(yú)腥草、浙貝母、金銀花、大黃、石膏、桃仁等共13 味藥。全方合用宣肺平喘，清肺解毒，清瀉兼顧，以瀉代清，肺與大腸同治，治氣分防血分；又可化濁辟穢，故可用于寒濕郁肺及疫毒閉肺證。

2020年2月18日納入安康市傳染病院共24例COVID-19患者，其中22例診斷為寒濕郁肺證，2 例疫毒閉肺證，采用柴平湯及我院制備的宣白清肺解毒湯，從發(fā)病到癥狀完全消失，其中最短為2 d，最長(zhǎng)為18 d，平均7.66 d。截至2020年2月24日，17例患者治愈出院，無(wú)一例病情加重[3]。此方相繼在我市疑似COVID-19患者，社區(qū)獲得性肺炎中觀察具有一定的療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)生物科學(xué)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選及分析，用于預(yù)測(cè)和研究多種藥物活性化合物作用于多靶點(diǎn)、多條通路及相關(guān)疾病發(fā)生的作用機(jī)制[4-5]。本研究旨在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上，篩選出宣白清肺解毒湯治療COVID-19的活性化學(xué)成分，并對(duì)相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行聚類(lèi)分析及代謝通路分析，為研究其可能的藥效作用途徑提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 宣白清肺解毒湯主要活性化合物的篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http：∥tcmsp.com/tcmsp.php)對(duì)13 味中藥所含活性成分及其性味歸經(jīng)信息進(jìn)行檢索，設(shè)定參數(shù)口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18，分子量(MW)≤500， 氫鍵受體數(shù)目(Hacc)<10，氫鍵給體數(shù)目 (Hdon)<5，分別構(gòu)建宣白清肺解毒湯化學(xué)成分及其歸經(jīng)信息數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和相關(guān)疾病靶點(diǎn)的收集

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)13味中藥活性化合物對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)信息，構(gòu)建靶標(biāo)信息庫(kù)，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)使其標(biāo)準(zhǔn)化，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因名。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(http：∥www.genecards.org/)檢索與COVID-19相關(guān)的基因。

1.3 化合物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：∥string-db.org/)錄入宣白清肺解毒湯治療COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)，在“organism”中選擇“homo sapiens”進(jìn)行檢索，獲得蛋白相互作用關(guān)系并進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建化合物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行模塊化分析。

1.4 宣白清肺解毒湯治療COVID-19靶點(diǎn)富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：∥david.ncifcrf.gov/)中對(duì)宣白清肺解毒湯治療COVID-19靶點(diǎn)相關(guān)通路進(jìn)行GO和KEGG富集分析，設(shè)定閾值P<0.05，使用R軟件對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行生物功能的可視化分析。

1.5 成分-靶點(diǎn)對(duì)接

從宣白清肺解毒湯中選取核心活性化合物山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素與COVID-19相關(guān)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)進(jìn)行對(duì)接，從RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)下載相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，并使用AutoDock軟件進(jìn)行加氫、加電子、加ROOT等操作。本次研究設(shè)定結(jié)合能小于-5 kJ/mol為結(jié)合顯著性，以此佐證宣白清肺解毒湯作用于COVID-19的合理性。

2 結(jié)果

2.1 宣白清肺解毒湯活性化學(xué)成分分析

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)13味中藥所含活性成分進(jìn)行檢索，按照類(lèi)藥五原則篩選得到122個(gè)活性成分，其中麻黃15個(gè)，浙貝母5個(gè)，魚(yú)腥草5個(gè)，苦杏仁17個(gè)，瓜蔞10個(gè)，大黃6個(gè)，金銀花15個(gè)，蒼術(shù)9個(gè)，檳榔5個(gè)，草果5個(gè)，桃仁22個(gè)，葶藶子8個(gè)，去掉重復(fù)值后共99個(gè)。通過(guò)在線(xiàn)Venny軟件分析此方交集化合物可知：山柰酚為麻黃、魚(yú)腥草、金銀花、葶藶子共有；木犀草素為麻黃、金銀花共有； β-谷甾醇為麻黃、浙貝母、大黃、金銀花、桃仁、葶藶子共有。具體交集化合物參數(shù)如表1所示。

表1 宣白清肺解毒湯中交集化合物

2.2 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將得到的活性化合物通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，共得到638個(gè)靶點(diǎn)蛋白，利用Cytoscape軟件構(gòu)建草藥-化學(xué)物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。其中黃色代表中藥，紫色代表各藥物獨(dú)有的化學(xué)成分(每個(gè)中藥用其首字母縮寫(xiě)代表)，藍(lán)色代表共有活性化合物(A1～J1)，綠色代表靶點(diǎn)。通過(guò)在線(xiàn)分析網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)湫再|(zhì)，以節(jié)點(diǎn)的大小表示度值的大小。由圖1可知，網(wǎng)絡(luò)圖包括319 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 094 條邊，其中度值最大的前3位藥材分別是桃仁(16)、金銀花(14)、麻黃(13)。度值最大的前3位藥物活性成分分別為A1、C1、B1；所對(duì)應(yīng)的化合物及度值分別為山柰酚(252)、β-谷甾醇(126)、木犀草素(101)。按度值由大到小排名前3的靶點(diǎn)分別為NCOA2、PTGS2、GABRA1。

圖1 草藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 預(yù)測(cè)宣白清肺解毒湯治療COVID-19靶點(diǎn)

根據(jù)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)找到COVID-19相關(guān)治療靶點(diǎn)259 個(gè)，運(yùn)用Venny平臺(tái)查找宣白湯與COVID-19靶點(diǎn)交集，得到35 個(gè)共有靶點(diǎn)，如圖2所示。

圖2 交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)String在線(xiàn)分析35個(gè)共有靶點(diǎn)，并設(shè)置參數(shù)去掉游離靶蛋白，得到PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)， PPI網(wǎng)絡(luò)圖共包括34個(gè)節(jié)點(diǎn)，350條邊。通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，結(jié)果顯示靶蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值為20.6，最大值為30，最小值為4，高于平均度值的靶點(diǎn)共23個(gè)，其中度值>25有13個(gè)，這些靶點(diǎn)可能是參與宣白清肺解毒湯治療COVID-19的關(guān)鍵靶點(diǎn)。關(guān)鍵靶點(diǎn)及度值信息如表2所示。

表2 宣白清肺解毒湯關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

圖3 宣白清肺解毒湯PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點(diǎn)通路GO富集分析

從DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選GO富集分析得到GO條目共192個(gè)，其中細(xì)胞組成條目16個(gè)，生物學(xué)過(guò)程條目157個(gè)，分子功能條目19個(gè)。通過(guò)R軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析，得到GO富集分析氣泡圖(圖4～圖6)。其中橫坐標(biāo)表示富集因子，縱坐標(biāo)表示富集條目，氣泡的大小表示富集個(gè)數(shù)，氣泡的顏色表示P值大小。生物學(xué)過(guò)程基因參與最多的條目及個(gè)數(shù)分別為缺乏配體的外源性凋亡信號(hào)通路(14)、藥物反應(yīng)(14)、脂多糖介導(dǎo)信號(hào)通路(13)；細(xì)胞組成過(guò)程基因參與最多的條目及個(gè)數(shù)分別為：細(xì)胞質(zhì)(22)、胞質(zhì)溶膠(20)，細(xì)胞核(19)；分子功能過(guò)程基因參與最多的條目及個(gè)數(shù)分別為：蛋白結(jié)合(30)、相似蛋白結(jié)合(13)、蛋白均聚活性(12)。

圖4 宣白清肺解毒湯核心作用靶點(diǎn)BP氣泡圖

圖5 宣白清肺解毒湯核心作用靶點(diǎn)CC氣泡圖

圖6 宣白清肺解毒湯核心作用靶點(diǎn)MF氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集篩選得到35個(gè)富集條目(P<0.01)，如圖7所示。其中與疾病相關(guān)的條目為結(jié)核病、乙型肝炎、美洲錐蟲(chóng)病等，以及癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等相關(guān)通路條目。對(duì)KEGG的35條結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，可得到8類(lèi)，其中計(jì)數(shù)>10的分別為乙型肝炎(14)、美洲錐蟲(chóng)病(13)、TNF信號(hào)通路(10)、甲型流感(10)、阿米巴原蟲(chóng)病(10)。

圖7 核心活性靶點(diǎn)KEGG代謝通路氣泡圖

2.7 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

如圖8所示，3種核心化合物與ACE2結(jié)合能均小于-5 kJ/mol ，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高，說(shuō)明該類(lèi)化合物可以直接作用于宿主人體細(xì)胞，提高機(jī)體免疫力，阻斷病毒侵襲。

A：山柰酚-ACE2：結(jié)合能-5.04 kJ/mol；結(jié)合位點(diǎn)：ASP543，GLU310，ASN546，SER545；B：β-谷甾醇-ACE2：結(jié)合能-6.24 kJ/mol；結(jié)合位點(diǎn)：GLU549；C：木犀草素-ACE2：結(jié)合能-5.1 kJ/mol；結(jié)合位點(diǎn)：SER411；GLN-526

3 討論

中藥復(fù)方組分自身的復(fù)雜性決定了其通過(guò)多成分作用于多個(gè)不同靶點(diǎn)而形成多維藥理發(fā)揮體系，從而達(dá)到治療疾病的目的[6]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)和方法，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘共找到宣白清肺解毒湯的活性化學(xué)成分122個(gè)，靶點(diǎn)1 038個(gè)，與COVID-19交集靶點(diǎn)35個(gè)，GO富集分析192條，KEGG富集分析得到35個(gè)條目，聚類(lèi)分析得到8類(lèi)不同通路。

宣白清肺解毒湯性味歸經(jīng)分析結(jié)果顯示，前5個(gè)度值最高的中藥活性化合物為山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、常春藤苷元、漢黃芩素。COVID-19危重癥的臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征和急性肺損傷，其可能與革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素(脂多糖)及感染導(dǎo)致的膿毒癥有關(guān)[7]。研究表明，山柰酚、β-谷甾醇可以減輕脂多糖導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷[8-9]；而木犀草素、常春藤苷元和漢黃芩素均具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[10-11]。

在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中得到與COVID-19交集自由度較高的靶點(diǎn)有BCL2L1、TP53、Bad、CASP8、CASP3。BCL2L1為最經(jīng)典的抗凋亡基因，同時(shí)又能調(diào)控自噬，與PPAR-γ、NF-κB、HIF-1 等信號(hào)通路有關(guān)[12]。TP53為常見(jiàn)促癌基因，其突變主要與腫瘤的惡性進(jìn)展、復(fù)發(fā)等存在一定的關(guān)聯(lián)[13]。Bad是bcl-2家族新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡促進(jìn)基因，可與TP53在線(xiàn)粒體上形成Bad/p53復(fù)合物，通過(guò)誘導(dǎo)Bak的活化和寡聚化從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

GO富集結(jié)果顯示，在生物學(xué)過(guò)程富集條目最多的是缺乏配體的外源性凋亡信號(hào)通路、藥物反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)信號(hào)通路等。嚴(yán)重的獲得性肺炎患者表現(xiàn)出活性氧、 TNF-α和IL-6顯著增加[15]。從KEGG富集分析結(jié)果可知，在治療過(guò)程中涉及的通路主要有癌癥通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，通過(guò)抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路蛋白表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，達(dá)到抗腫瘤的效果[16]。TNF信號(hào)通路是參與炎癥反應(yīng)和免疫的主要通路之一，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。由此推測(cè)，宣白清肺解毒湯通過(guò)抑制炎癥浸潤(rùn)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等治療COVID-19。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素3種核心化合物與ACE2蛋白活性酶具有穩(wěn)定的結(jié)合活性，能通過(guò)直接作用于宿主人體細(xì)胞發(fā)揮阻斷病毒侵襲的作用，提示宣白清肺解毒湯所含活性化合物具有調(diào)控COVID-19相關(guān)靶標(biāo)的生物活性，具有一定的臨床防控新冠病毒的潛力，這與我們的臨床試驗(yàn)結(jié)果相符。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，運(yùn)用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索宣白清肺解毒湯活性化合物及潛在靶點(diǎn)，分析與COVID-19交集靶點(diǎn)，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)與靶點(diǎn)相關(guān)的通路及疾病信息，說(shuō)明宣白清肺解毒湯是通過(guò)多成分協(xié)同作用于多靶點(diǎn)及多個(gè)通路從而發(fā)揮治療COVID-19的作用，后期還需進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，確保其結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和可靠性。