羅婷怡， 孫偉， 楊庭松， 王士林， 霍鈺虎， 韋海鴻， 徐彬

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院普外科，上海 200072)

結(jié)直腸癌是全球高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中分別位居第三位和第二位[1-2]。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[3]。手術(shù)治療早期結(jié)直腸癌效果較好[4]，而中晚期患者預(yù)后較差，5年生存率不足15%[5]，化療耐藥是其預(yù)后不良的主要原因之一[6]。C14ORF169是定位于人體14號染色體上的基因，其表達(dá)C14ORF169蛋白，又名NO66，是含十字形結(jié)構(gòu)域蛋白(Jumonji domain-containing, Jmjd)去甲基化酶家族中的一員[7]，在組蛋白編碼[8]和癌癥的發(fā)生進(jìn)展中起重要作用[9-11]。研究顯示，C14ORF169在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括肺癌[12]、腎癌[13]、前列腺癌[14]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[15]等，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤生長。Nishizawa等[16]發(fā)現(xiàn)，C14ORF169可能是結(jié)直腸癌新的預(yù)后標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。然而，C14ORF169通過何種機(jī)制影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展，以及其對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響尚不清楚。因此，本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫，結(jié)合腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)，分析C14ORF169對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，同時(shí)通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討C14ORF169表達(dá)對結(jié)直腸癌患者化療的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)篩選

1.1.1 數(shù)據(jù)收集與分析 利用基因表達(dá)譜在線分析平臺GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)分析C14ORF169在人31種腫瘤組織樣本及其相應(yīng)正常組織中的差異表達(dá)。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)篩選出C14ORF169在結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)正常組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)篩選條件：“Gene: C14ORF169”；“Analysis Type: Cancer vs. Normal Analysis”；“Cancer Type： Colorectal cancer”；“Data Type: mRNA”。

1.1.2 從GEO數(shù)據(jù)庫選擇數(shù)據(jù) 從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下載基因表達(dá)譜結(jié)直腸癌樣本數(shù)據(jù)集GSE12945和GSE17536。收集GEO數(shù)據(jù)集中具有完整臨床病理學(xué)參數(shù)和生存資料的病例。采用X-Tile軟件[17]確定C14ORF169 mRNA表達(dá)量的最佳截?cái)嘀?，?jù)此將數(shù)據(jù)進(jìn)行二分類，低于該值為低表達(dá)組，高于則為高表達(dá)組。

1.2 細(xì)胞株、質(zhì)粒載體及主要試劑

結(jié)腸癌RKO和HCT116細(xì)胞株、Lenti-CAS9-puro質(zhì)粒、人腎上皮293T細(xì)胞、慢病毒表達(dá)載體GV371、GV513(BamHⅠ/NheⅠ酶切)、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒、慢病毒包裝試劑盒、大腸埃希菌、TOP 10感受態(tài)均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。T7 DNA 連接酶、BbsⅠ、瓊脂糖凝膠購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素小提中量試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；兔抗C14ORF169抗體(美國Abcam公司)；小鼠抗人GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.3 慢病毒構(gòu)建與包裝

針對目的基因C14ORF169序列，設(shè)計(jì)小向?qū)NA(small guide RNA，sgRNA)引物序列：GCCAGGACCGACCCGCTGTG，插入慢病毒質(zhì)粒載體Lenti-sgRNA-EGFP，獲得敲除質(zhì)粒Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP。從GV513載體獲得C14ORF169表達(dá)片段并插入慢病毒載體，獲得過表達(dá)質(zhì)粒Lenti-C14ORF169-gcGFP。用空載對照質(zhì)粒Lentil-CON-244-EGFP、敲除質(zhì)粒Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP、空載對照質(zhì)粒Lentil-CON-335-gcGFP、過表達(dá)質(zhì)粒Lenti-C14ORF169-gcGFP分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，按慢病毒包裝試劑盒說明書進(jìn)行病毒包裝，48 h后收集上清液過濾，熒光法測定病毒滴度后-80 ℃保存。

1.4 慢病毒感染RKO、HCT116細(xì)胞及穩(wěn)定敲除株與過表達(dá)株的篩選

將RKO細(xì)胞株、HCT116細(xì)胞株于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以5 × 104個(gè)/孔接種于6孔板。加入Lenti-CAS9-puro慢病毒，感染72 h；加入嘌呤霉素篩選3 d至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。然后以同樣的方法在RKO細(xì)胞中感染Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP慢病毒作為RKO-KO組(敲減C14ORF169)，感染對照質(zhì)粒Lentil-CON-244-EGFP作為RKO-NC組；在HCT116細(xì)胞中感染Lenti-C14ORF169-gcGFP慢病毒作為HCT116-OE組(C14ORF169過表達(dá)組)，感染對照質(zhì)粒Lentil-CON-335-gcGFP作為HCT116-NC組。收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫印跡法檢測細(xì)胞中C14ORF169蛋白表達(dá)

取“1.4”中HCT116-OE、HCT116-NC、RKO-KO、RKO-NC細(xì)胞樣品，PBS洗滌2次；加入預(yù)冷RIPA裂解液冰上裂解15 min；4 ℃ 12 000×g離心15 min；取上清液，BCA法測定蛋白濃度。在蛋白樣品中加入6×上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴10 min；取40 μg總蛋白行10%SDS-PAGE分離；4 ℃ 300 mA恒流電轉(zhuǎn)150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜；用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1 h；分別加入抗C14ORF169抗體與抗GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜4次，每次8 min；二抗室溫孵育1.5 h(1 ∶7 500)；TBST洗膜4次，每次8 min；采用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法結(jié)合顯色儀進(jìn)行蛋白檢測及發(fā)光，將曝光得到的目的條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，得到的數(shù)值用GraphPad Prism 9作圖。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞藥物敏感性

將篩選后的穩(wěn)定株HCT116-OE、HCT116-NC、RKO-KO、RKO-NC分別接種于96孔板中(5 000細(xì)胞/孔)，分別給予不同濃度梯度(0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，160.0 μg/mL)的5-氟尿嘧啶(5-FU)，于5% CO2、37 ℃分別孵育48、72 h；加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h；用酶標(biāo)儀于490 nm處測其光密度(D)值。根據(jù)不同濃度梯度下各組細(xì)胞的活性用GraphPad Prism 9繪制擬合曲線，計(jì)算5-FU半抑制濃度(IC50)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 C14ORF169 mRNA在多種人體腫瘤組織及對應(yīng)正常組織中的表達(dá)

基于GEPIA平臺分析TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)C14ORF169mRNA在人31種腫瘤組織樣本及其相應(yīng)正常組織中的差異表達(dá)，結(jié)果顯示，C14ORF169mRNA在結(jié)直腸腺癌(Colon Adenocarcinoma, COAD/Rectum Adenocarcinoma, READ)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、乳腺癌(BRCA)等大部分癌癥組織中呈高表達(dá)(圖1)。

ACC: 腎上腺皮質(zhì)癌；BLCA：膀胱上皮癌；BRCA:乳腺癌；CESC：宮頸鱗狀細(xì)胞癌；CHOL：膽管癌；COAD：結(jié)腸腺癌；DLBC：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；ESCA: 食管癌；GBM: 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；HNSC:頭頸鱗狀細(xì)胞癌；KICH：腎嫌色細(xì)胞癌；KIRC：腎透明細(xì)胞癌；KIRP: 腎乳頭狀細(xì)胞癌；LAML: 急性髓系白血?。籐GG:腦低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤；LIHC：肝細(xì)胞癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗狀細(xì)胞癌；OV：卵巢漿液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤；PRAD：前列腺癌；READ: 直腸腺癌；SARC: 肉瘤；SKCM：皮膚黑色素瘤；STAD: 胃腺癌；TGCT：睪丸生殖細(xì)胞瘤；THCA：甲狀腺癌；THYM：胸腺瘤；UCEC：子宮內(nèi)膜癌；UCS：子宮癌肉瘤

2.2 C14ORF169 mRNA在不同結(jié)直腸癌基因芯片中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，C14ORF169mRNA在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平均高于正常組織。4項(xiàng)有關(guān)C14ORF169mRNA在結(jié)直腸腺瘤組織與正常組織中的表達(dá)差異分析顯示[18-19]，C14ORF169mRNA在結(jié)直腸腺瘤組織表達(dá)高于正常組織(P<0.001，圖2A)。將5項(xiàng)關(guān)于C14ORF169mRNA在結(jié)直腸癌組織與正常組織中表達(dá)差異的分析進(jìn)行Meta分析，結(jié)果亦顯示，C14ORF169mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(P=0.001，圖2B)。

圖2 不同結(jié)直腸腫瘤芯片C14ORF169 mRNA研究的Meta分析

2.3 C14ORF169 mRNA表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性

在GSE12945數(shù)據(jù)集中，C14ORF169mRNA表達(dá)的最佳截?cái)嘀禐?0.75。將GSE12945數(shù)據(jù)集中62例結(jié)直腸癌患者按C14ORF169mRNA表達(dá)的最佳截?cái)嘀捣譃楦弑磉_(dá)組和低表達(dá)組。其中，高表達(dá)組10例，低表達(dá)組52例。采用log-rank法進(jìn)行生存分析結(jié)果顯示，C14ORF169mRNA高表達(dá)患者總體生存時(shí)間和無病生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)患者(P<0.05)。見圖3。在GSE17536數(shù)據(jù)集中，C14ORF169mRNA表達(dá)的最佳截?cái)嘀禐?.44。177例結(jié)直腸癌患者按最佳截?cái)嘀捣譃楦弑磉_(dá)組和低表達(dá)組。其中，高表達(dá)組54例，低表達(dá)組123例。生存分析結(jié)果亦顯示，C14ORF169mRNA高表達(dá)組總體生存時(shí)間和疾病特異性生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)組(P<0.05)。見圖4。

圖3 C14ORF169 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系(GSE12945數(shù)據(jù)集)

圖4 C14ORF169 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系(GSE17536數(shù)據(jù)集)

2.4 C14ORF169 mRNA表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

由表1可見，C14ORF169mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌AJCC分期密切相關(guān)，腫瘤組織C14ORF169mRNA表達(dá)越高，AJCC分期越晚(P<0.05)。而C14ORF169mRNA表達(dá)與年齡、性別、病理分級無明顯相關(guān)性(P>0.05)。由此提示，C14ORF169mRNA高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致預(yù)后不良。

表1 C14ORF169 mRNA表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 例

2.5 C14ORF169蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

由圖5可見，與對照組RKO-NC細(xì)胞相比，RKO-KO細(xì)胞中C14ORF169蛋白表達(dá)顯著降低(t=475.0，P<0.05)，說明RKO細(xì)胞C14ORF169敲減穩(wěn)定株構(gòu)建成功；與對照組HCT116-NC細(xì)胞相比，HCT116-OE組C14ORF169蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(t=286.3，P<0.05)，由此說明HCT116細(xì)胞C14ORF169過表達(dá)穩(wěn)定株構(gòu)建成功。

圖5 免疫印跡法檢測HCT116和RKO細(xì)胞系中C14ORF169蛋白表達(dá)

2.6 細(xì)胞藥物敏感性

CCK-8結(jié)果顯示，相較于RKO-NC組細(xì)胞，C14ORF169敲減后的RKO-KO組細(xì)胞對5-FU的敏感性明顯增加，48 h和72 h的IC50值分別為0.739 μg/mL和0.343 μg/mL；而C14ORF169過表達(dá)的HCT116-OE組細(xì)胞，在48 h和72 h的IC50值分別為3.581 μg/mL和1.909 μg/mL，相較于HCT116-NC組細(xì)胞，其對5-FU敏感性明顯降低(圖6)。結(jié)果表明，C14ORF169高表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-FU敏感性，反之則增強(qiáng)。

圖6 C14ORF169表達(dá)量不同的細(xì)胞系在不同時(shí)間點(diǎn)5-FU的IC50測定結(jié)果

3 討論

本研究基于GEPIA平臺分析TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)C14ORF169mRNA在多種腫瘤組織樣本及其相應(yīng)正常組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，C14ORF169mRNA在結(jié)直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、乳腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)較正常組織明顯上調(diào)。同時(shí)，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)C14ORF169mRNA在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平均高于正常組織，說明C14ORF169作為一種腫瘤分子標(biāo)志物，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步分析GEO數(shù)據(jù)庫中檢索的GSE12945數(shù)據(jù)集和GSE17536數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，C14ORF169mRNA高表達(dá)結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間與疾病特異性生存時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，并且C14ORF169mRNA高表達(dá)與結(jié)直腸癌AJCC分期明顯相關(guān)(P<0.05)，說明C14ORF169mRNA高表達(dá)往往導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展迅速、預(yù)后較差，C14ORF169是結(jié)直腸癌的預(yù)后危險(xiǎn)因子，可能是結(jié)直腸癌中一種新的生物標(biāo)志物。

淋巴管血管侵犯是結(jié)直腸癌明顯的預(yù)后不良因素[20]。小脈管受侵與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且是獨(dú)立的預(yù)后不良因素，腸壁外大靜脈受侵也是獨(dú)立的預(yù)后不良因素，提示有肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。若不進(jìn)行治療，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的中位生存期僅僅只有6～9個(gè)月[21]。已有淋巴管血管侵犯的結(jié)直腸癌患者往往已處于AJCC分期晚期。本研究結(jié)果顯示，C14ORF169高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者多屬于AJCC晚期。而已有研究表明，C14ORF169高表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移、淋巴管血管侵犯密切相關(guān)[16]。由此提示，C14ORF169可能通過促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為而引起患者預(yù)后不良。

5-FU常用于結(jié)直腸癌化療[22]，通常與奧沙利鉑、亞葉酸鈣聯(lián)合用于晚期或者轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線治療，降低AJCCⅢ期患者的腫瘤復(fù)發(fā)率[20]，有效延長患者生存期，改善生活質(zhì)量。而化療耐藥患者往往療效不佳、預(yù)后差[23]，化療耐藥與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[24]。近年來，隨著對腫瘤分子生物學(xué)的不斷研究，對腫瘤中特定靶向分子的治療已成為抗腫瘤藥物的研發(fā)重心。本研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中敲減C14ORF169后，結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU敏感性增加，而高表達(dá)C14ORF169的結(jié)腸癌細(xì)胞則對5-FU表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性。由此提示，C14ORF169可能通過增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療耐藥性而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

綜上所述，C14ORF169在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，高表達(dá)C14ORF169的結(jié)直腸癌患者總體生存時(shí)間和疾病特異性生存時(shí)間明顯縮短，預(yù)后不良。這與C14ORF169高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者多屬于AJCC晚期相關(guān)，也與C14ORF169高表達(dá)能增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-FU的化療耐藥有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和探討。