程文豪， 盧雨沫， 胡文龍， 劉忠倫， 任虹

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院皮膚性病科，江蘇 連云港 222000)

梅毒是由蒼白密螺旋體引起的慢性傳染性疾病，主要通過性接觸傳播。梅毒臨床表現(xiàn)多樣，且在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播[1]。梅毒目前主要依靠血清學(xué)檢查來診斷和評估治療效果[2]，大部分梅毒患者在正規(guī)治療后能達(dá)到臨床治愈和血清治愈(非梅毒螺旋體抗原實驗轉(zhuǎn)為陰性)，但有些患者可表現(xiàn)為長時間梅毒血清學(xué)陽性，這種情況稱為梅毒血清固定或血清抵抗[3-4]。近年來隨著梅毒發(fā)病率的顯著升高，血清固定的發(fā)生率也明顯有隨之升高趨勢[5]。梅毒患者出現(xiàn)血清固定的機(jī)制尚不明確，近來研究發(fā)現(xiàn)，梅毒血清固定患者的免疫功能發(fā)生了轉(zhuǎn)變[6]。

NK細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可以通過細(xì)胞毒機(jī)制直接殺傷病原體。NK細(xì)胞作為天然免疫系統(tǒng)的核心成員，在血清固定形成中發(fā)揮重要作用[7]。在免疫應(yīng)答中，NK細(xì)胞增殖、分化、遷移等生物學(xué)效應(yīng)受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，其中IL-21[8-10]、IL-18[11-12]和IL-15[13-14]等細(xì)胞因子對NK細(xì)胞的調(diào)控作用尤為明顯。本研究從細(xì)胞免疫方面入手，比較梅毒血清固定患者與健康者外周血IL-15、IL-18、IL-21和NK細(xì)胞變化水平，并分析其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 一般資料

選取2018年10月至2020年9月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院皮膚性病科收治的24例梅毒血清固定患者為血清固定組，其中男10例，女14例，平均年齡(34.79±12.61)歲(17～58歲)。血清固定平均時間(5.88±6.52)年(1～31年)，快速血漿反應(yīng)素試驗(RPR)檢測滴度1 ∶1者6例，1 ∶2者5例，1 ∶4者8例，1 ∶8者5例。一期梅毒產(chǎn)生血清固定4例，二期梅毒5例，潛伏梅毒15例(表1)。TRUST試驗初始滴度為1 ∶2～1 ∶128。梅毒患者均經(jīng)過規(guī)范的驅(qū)梅治療和充分隨訪(一期梅毒、二期梅毒和晚期梅毒隨訪時間分別為1年、2年和3年)，RPR滴度維持在1 ∶1～1 ∶8之間超過3個月，排除生物學(xué)假陽性、再感染、神經(jīng)梅毒、心血管梅毒等。選取性別與年齡相匹配的24例梅毒螺旋體顆粒凝集試驗、RPR均陰性的健康體檢者作為健康對照組，其中男、女各12例，平均年齡(34.75±11.81)歲(19～57歲)。受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：無嚴(yán)重感染性疾病、惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病，HIV抗體陰性，半年內(nèi)未使用過免疫調(diào)節(jié)藥物，排除妊娠期女性。本研究通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

表1 24例梅毒患者血清固定形成時間和滴度

1.2 主要試劑和儀器

CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC四色試劑，血細(xì)胞分析用溶血劑均為美國Agilen公司產(chǎn)品；人IL-15、IL-18、IL-21定量 ELISA 試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；EDTA-K2抗凝劑的真空采血管、BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀均為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 血樣采集及處理

用含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管，清晨采集受試者空腹肘靜脈血5 mL。取1 mL靜脈血至干燥潔凈的EP管內(nèi)，做好標(biāo)記(姓名、性別、年齡、采集時間)，室溫放置保存，24 h內(nèi)檢測NK細(xì)胞水平。余4 mL靜脈血，于30 min內(nèi)，室溫1 000×g離心15 min，取上層血漿，做好標(biāo)記，于-80 ℃冰箱中保存，用于細(xì)胞因子IL-15、IL-18和IL-21水平檢測。

1.4 ELISA法檢測IL-15、IL-18和IL-21水平

將成倍稀釋的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測血漿分別置于相應(yīng)微孔，每孔100 μL，并增加1孔作為空白對照孔，每組設(shè)2個復(fù)孔，37 ℃孵育90 min；洗板4次，每孔加入生物素化抗體工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；洗板4次，每孔加入酶結(jié)合物工作液50 μL，37 ℃孵育30 min；洗板4次，每孔加入顯色劑100 μL，37 ℃避光孵育10 min；每孔加入終止液100 μL，立刻用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔光密度值(D值)。以標(biāo)準(zhǔn)品D值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(IL-15、IL-18和IL-21標(biāo)準(zhǔn)曲線R2分別為0.997 2、0.995 6、0.998 3)，計算樣本濃度。實驗步驟和方法均按照說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

1.5 流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法檢測外周血NK細(xì)胞水平

用反向加樣法取50 μL靜脈血加入流式管，再加入20 μL四色抗體試劑，輕輕充分混勻后，室溫靜置避光孵育15 min；然后加入450 μL紅細(xì)胞溶解劑，混勻，室溫靜置避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。所有實驗方法的操作規(guī)程參照試劑及儀器的說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.6 血清固定組和健康對照組患者外周血中NK細(xì)胞水平Meta分析

中文檢索詞以“血清固定或血清抵抗”和“自然殺傷細(xì)胞或NK細(xì)胞”為并列檢索詞，英文檢索詞為“serofast or seroresistance” and “natural killer cells or NK cells”。計算機(jī)檢索中國知網(wǎng)、萬方、維普、PubMed、EmBase、Cochrane Library等數(shù)據(jù)庫，查找自建庫至2020年10月關(guān)于NK細(xì)胞和梅毒血清固定的文獻(xiàn)，檢索語言不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：不滿足上述納入標(biāo)準(zhǔn)的研究；納入兒童、孕婦的研究；綜述性文獻(xiàn)；重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；資料不完整的研究。提取的數(shù)據(jù)包括文章作者、發(fā)表年份、樣本量和NK細(xì)胞比例(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Stata 15.0軟件進(jìn)行Meta分析，計算95%CI和標(biāo)準(zhǔn)化平均差(standardised mean difference，SMD)， 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性檢驗，若P>0.1、I2≤50%，表示各研究之間不存在異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析；若P<0.1、I2>50%，表示存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。Egger′s檢驗評估發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 血清固定組與對照組外周血IL-15、IL-18和IL-21水平比較

由表2可見，血清固定組外周血IL-18和IL-21水平顯著低于健康對照組(U=6.402，t=5.939，P均<0.001)。與健康對照組相比，血清固定組外周血IL-15水平稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.385，P=0.173)。

表2 兩組外周血IL-15、IL-18、IL-21水平比較

2.2 血清固定組與對照組外周血NK細(xì)胞比例比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，固定組外周血NK細(xì)胞比例[(17.57±5.23)%]明顯低于對照組[(23.46±7.66)%，t=3.105，P=0.003]。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測血清固定患者與健康對照者外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平

2.3 外周血中NK細(xì)胞水平Meta分析

鑒于本研究的樣本量較小，通過檢索策略檢索到文獻(xiàn)共267篇，按照文獻(xiàn)的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)最終納入16篇文獻(xiàn)[15-30]進(jìn)行Meta分析，納入研究的基本特征見表3，加上本次實驗數(shù)據(jù)，得到血清固定組655例，健康對照組586例。經(jīng)同質(zhì)性檢驗，各研究之間存在異質(zhì)性(I2=92.20%，P<0.001)，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與健康對照組相比，血清固定患者外周血NK細(xì)胞百分比明顯減低[SMD=-0.64，95%CI(-1.08，-0.21)，P<0.001]。見圖2。Egger′s 檢驗發(fā)現(xiàn)存在發(fā)表偏倚(P=0.296)。

表3 納入Meta分析研究的基本特征

圖2 血清固定組與對照組外周血NK細(xì)胞百分比Meta分析森林圖

3 討論

NK細(xì)胞在激活后迅速分泌大量細(xì)胞因子控制病原體的增殖，而且激活的速度和強(qiáng)度高于T細(xì)胞[31-33]。NK細(xì)胞在感染后可以迅速地被檢測到，是評估機(jī)體細(xì)胞免疫功能的常用指標(biāo)。近年來，國內(nèi)外越來越多學(xué)者研究證實梅毒血清固定的發(fā)生與機(jī)體免疫受到抑制有關(guān)[34-35]。本實驗結(jié)果顯示，血清固定患者外周血中NK細(xì)胞比例明顯低于健康對照組，提示血清固定患者免疫功能受到抑制，機(jī)體對梅毒螺旋體的免疫清除能力降低，可能引起血清固定。

既往有研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，血清固定患者外周血中NK細(xì)胞水平明顯降低[15，21]。然而，也有學(xué)者指出血清固定患者外周血NK細(xì)胞水平與健康對照組相比未見降低[17]。這些結(jié)果研究樣本量均較小且結(jié)果并不一致，通過納入16篇文獻(xiàn)，加上本次實驗結(jié)果，共對655例血清固定患者和586例健康對照者進(jìn)行Meta分析。結(jié)果顯示，血清固定組外周血NK細(xì)胞水平顯著低于健康對照組。本Meta分析檢索了國內(nèi)外權(quán)威的中英文數(shù)據(jù)庫，納入所有關(guān)于NK細(xì)胞與梅毒血清固定，且符合標(biāo)準(zhǔn)的病例對照研究，但沒有檢索到國外的相關(guān)研究，僅展現(xiàn)國內(nèi)地區(qū)NK細(xì)胞與梅毒血清固定相關(guān)性的研究情況。雖然結(jié)果也存在一定的異質(zhì)性和發(fā)表偏倚，但是是對多個獨(dú)立臨床病例對照研究的薈萃分析，相較于單一臨床病例對照研究，受試者更多，覆蓋面更廣，結(jié)果可信度更高。

既往關(guān)于血清固定與NK細(xì)胞的研究主要集中于外周血中NK細(xì)胞自身水平的變化[16，19]，本研究在檢測NK細(xì)胞的同時，還探究了NK細(xì)胞上游細(xì)胞因子IL-21、IL-18和IL-15的水平；這些細(xì)胞因子可以獨(dú)立或協(xié)同正向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的數(shù)量和功能[33]。結(jié)果顯示，血清固定患者外周血中IL-21和IL-18水平明顯低于健康對照組，這也在一定程度上支持了前文得出的血清固定患者外周血中NK細(xì)胞水平降低的結(jié)論；但I(xiàn)L-15水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)梅毒血清固定患者外周血中NK細(xì)胞及其上游細(xì)胞因子IL-18、IL-21含量降低，提示梅毒血清固定患者免疫功能受抑制，對梅毒螺旋體的免疫清除能力減弱，梅毒螺旋體殘存于體內(nèi)時間增長，可能是梅毒血清固定形成的原因之一。同時，外周血中NK細(xì)胞及其上游細(xì)胞因子IL-18、IL-21的含量或有望成為血清固定診斷的輔助指標(biāo)。但目前研究的樣本量較小，還需高質(zhì)量、多中心、大樣本進(jìn)一步臨床驗證。