李曉娟，馮 帆，李瑞生，貌盼勇

肝細胞癌是我國乃至全世界最常見的高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第三位，病死率高居第二位[1-3]。另外，我國是乙型肝炎高發(fā)國家，因此造成肝細胞癌發(fā)病率居高不下[4-5]。肝細胞癌的早期診斷普及程度低，多數(shù)患者確診時已為晚期[6]，失去了手術的機會，即使進行了手術治療，術后復發(fā)率也較高[7]。因此，建立能夠模擬臨床特征的肝細胞癌動物模型，對于肝細胞癌的發(fā)生機制、早期診斷、早期干預治療及新型治療方法評估等方面的研究具有重要的意義[8]。

目前研究肝細胞癌常用的實驗動物模型包括細胞系腫瘤（cell line-derived xenografts, CDX）模型、人源異種移植（patient-derived xenograft,PDX）模型和遺傳工程小鼠模型（geneticallyengineered mouse models, GEMM）等。PDX模型是將取自臨床患者的新鮮腫瘤組織直接異種移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的動物模型[9]。相較于其他類型動物模型，PDX模型更大程度地保留了人類原發(fā)腫瘤的結構、細胞（如淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等）以及細胞外基質(zhì)，能夠更好地反映腫瘤細胞與正常細胞及周圍基質(zhì)之間的密切聯(lián)系和相互作用，在模擬人體腫瘤組織的血管生成、發(fā)生發(fā)展甚至轉移等方面具有明顯的優(yōu)勢[10-11]。同時PDX模型不僅能夠保留原代腫瘤的遺傳學特征（如原始癌癥的表型和分子特征），也可作為篩選抗癌藥物、評價藥物的臨床療效及不良反應很好的工具[12]，還能準確反映人類腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性[13]，在藥物有效性研究、臨床預后預測等方面優(yōu)勢明顯[14]。PDX模型還能夠保留不同患者原代腫瘤的特性并對原代腫瘤進行傳代，可作為腫瘤個性化治療的研究標本[15]。因此，肝細胞癌PDX模型在藥物和生物標志物篩選及聯(lián)合臨床試驗中顯示出作為臨床前模型的優(yōu)勢。

PDX模型構建的成功率與很多因素有關，如腫瘤的類型和惡性程度、受體動物類型、移植方法和部位等[12]。本文對肝細胞癌PDX模型構建中所需實驗動物的類型、移植部位和方法、移植手術的影響因素以及PDX模型在肝細胞癌研究應用中的最新進展進行綜述。

1 肝細胞癌PDX模型實驗動物的選擇

PDX模型是不同物種之間的移植類型，必須選用具有免疫缺陷的小鼠。

1.1 裸小鼠 裸小鼠的主要特征是缺乏成熟的T淋巴細胞，而B淋巴細胞正常，但功能不完善。最常用的品系為BALB/c裸小鼠。裸小鼠幼年時NK細胞活性低下，成年后NK細胞會恢復至略高于正常小鼠，同時T淋巴細胞也會增加，這些恢復的NK細胞、巨噬細胞以及抗原提呈細胞等使裸小鼠的移植排斥作用也隨之增加[16]。因此一般選用4～6周齡裸小鼠。在移植腫瘤實驗操作中，無須對裸小鼠進行前處理，成功率較高，移植傳代后的腫瘤組織能夠很好地保留其原有的特性。

1.2 重度聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）小鼠 SCID小鼠被毛正常，T、B淋巴細胞均缺失，異種移植腫瘤組織的成功率明顯高于裸小鼠。在SCID小鼠體內(nèi)能夠觀察到較高的腫瘤轉移率，因此可作為研究腫瘤生長轉移和免疫治療的良好模型[17]。SCID小鼠的T、B淋巴細胞的免疫功能也會隨著周齡的增加部分恢復[18]。研究者為保證移植成功率，首次移植可以先選擇SCID小鼠，而在后續(xù)移植傳代中為了延長觀察時間和節(jié)省研究經(jīng)費選用裸小鼠[19]。

1.3 NOD/SCID小鼠 NOD/SCID小鼠是由NOD/Lt小鼠（胰島素依賴性糖尿病小鼠）和SCID小鼠雜交獲得，該小鼠T、B淋巴細胞缺陷，NK細胞活性很低，巨噬細胞和抗原提呈細胞的功能也受到損害。由于其免疫缺陷程度高，不易發(fā)生免疫逃逸，因此其異種移植成功率顯著高于SCID小鼠，是目前公認異種移植腫瘤動物模型理想的選擇之一。但該小鼠的壽命較短，不建議進行實驗周期較長的研究。

1.4 NOG小鼠 NOG小鼠是由NOD/SCID小鼠與IL-2γnullKO小鼠雜交而獲得，缺乏T、B淋巴細胞和NK細胞，樹突狀細胞和巨噬細胞功能減退，補體活性缺乏，其免疫功能嚴重不全，因此異種移植成功率顯著高于NOD/SCID小鼠，也是公認的異種移植模型理想的選擇之一，廣泛應用于免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和腫瘤方面的研究領域[20]。

1.5 B-NSG小鼠 B-NSG小鼠是利用基因編輯技術將NOD小鼠Prkdc和IL2rg雙基因敲除而獲得。該小鼠沒有成熟T、B淋巴細胞和功能性NK細胞，細胞因子信號傳遞能力缺失，對人源組織幾乎不存在排斥反應，免疫缺陷程度最高。同時其平均壽命長達1.5年，是進行人源細胞或組織移植最理想的模型小鼠。

總之，免疫缺陷小鼠種類較多，研究者可根據(jù)課題的需求及經(jīng)費等方面綜合考慮，選擇不同免疫缺陷小鼠用以發(fā)揮最佳作用，為肝細胞癌的研究提供合適的PDX模型（見表1）。

表1 PDX模型常用免疫缺陷小鼠總結Table 1 Summary of immunodeficient mice commonly used in PDX model

2 肝細胞癌PDX模型移植部位和方法的選擇

2.1 皮下移植 皮下移植實驗操作簡單易行，便于觀察，是最常采用的方法。移植部位多選擇頭部皮下、腋下或雙側腹股溝。這些部位操作簡單，腫瘤易成活，且易于觀察腫瘤，腫瘤的生長也不會影響小鼠的正?；顒?。該方法常應用于肝細胞癌新藥物篩選實驗、藥物療效對比實驗等研究[21-22]。但由于小鼠皮下缺乏腫瘤相關的微環(huán)境，很少會出現(xiàn)腫瘤的遠處轉移現(xiàn)象，因此這種方式不適用于構建分化程度高、惡性程度低的腫瘤移植模型[23]。

2.2 肝臟原位移植 肝臟原位移植的方式分為原位注射懸液與原位微組織塊移植兩種。原位注射懸液操作簡單，部分研究者采用了此法[24]。原位微組織塊移植是將腫瘤組織切成微組織塊移植到與原發(fā)部位相同的動物臟器，也稱為患者源性原位異種移植（patient-derived orthotopic xenograft,PDOX）。微組織塊能夠很好地保留人源肝臟腫瘤的微環(huán)境，而腫瘤周邊的小鼠肝臟供給腫瘤生長所需營養(yǎng)，不但能夠更好地模擬肝臟腫瘤的生長、浸潤和轉移，還能夠保留患者肝臟腫瘤組織的異質(zhì)性。相比于皮下移植方式，PDOX模型能夠更準確地模擬腫瘤在人體內(nèi)的進展全過程，同時更易出現(xiàn)與臨床相似的腫瘤轉移特征[25]。但原位移植手術操作相對復雜，成瘤率較低，而且不能直接觀察，須剖腹才能順利觀察腫瘤的生長情況，是其發(fā)展推廣的瓶頸。因此，研究者借助多項影像學技術手段，同時依托PDX模型來評價新型影像學技術在肝細胞癌早期的預防與診斷，對肝細胞癌的后續(xù)治療與預后可提供寶貴的指導意見。Yang等[26]利用PET技術對肝癌細胞系、肝癌細胞移植模型和PDX模型進行了對比檢測，評價PET對早期肝細胞癌的檢測能力和預測能力。Zhang等[27]利用NIRF/PET雙模成像探針對小鼠PDX、CDX模型及家兔肝細胞癌模型進行對比檢測分析，以期成為肝細胞癌早期預測和檢測的有力手段。

2.3 人源化異種移植模型 目前多數(shù)構建的PDX模型都有一個相同的缺陷，那就是缺乏人類的免疫大環(huán)境，因此研究者開發(fā)出人源化異種移植模型。在造模過程中，不僅移植人源腫瘤組織，還將其他人源組織和細胞導入或將人類某些特定基因敲入免疫缺陷動物體內(nèi)，使移植的腫瘤能夠更好地在與人類非常相似的免疫大環(huán)境中模擬生長[25，28]。Zhao等[29]在傳統(tǒng)PDX模型的基礎上，成功建立了肝細胞癌PDX人源化模型，即具備人類免疫系統(tǒng)的PDX模型，能夠對肝細胞癌的免疫治療效果進行評價。而Jiang等[30]利用 NOD/SCID/IL2rg?/?小鼠建立 PDX 模型，評價Glypican 3-CAR T細胞對肝細胞癌PDX模型的有效性以及對臨床的指導意義。此類人源化異種移植模型的優(yōu)勢在于模擬了更加相似的人體腫瘤微環(huán)境和大環(huán)境，使腫瘤生物學行為充分表達，還可減少腫瘤傳代過程中出現(xiàn)的組織差異，因此在腫瘤免疫學研究方面具有顯著優(yōu)勢[31]。但該模型對技術要求較高，操作有一定難度，難以得到廣泛應用。

綜上所述，影響PDX模型構建的因素主要包括：①實驗動物的選擇。綜合各項因素首選NOD/SCID小鼠和NOG小鼠。②腫瘤組織特性。腫瘤標本的病理類型、分化程度和惡性程度等對構建的模型影響也較大[32]。臨床預后不良的患者，其腫瘤的分化程度低，惡性程度高，異種移植的成瘤率高，相反則低。③手術操作的影響。新鮮腫瘤標本從患者體內(nèi)取出后，應以最快速度保存于4 ℃培養(yǎng)基中[33]，隨后異體移植盡量在離體1 h內(nèi)完成；手術操作的熟練程度及手術全程的無菌意識均影響成瘤率。

3 PDX模型在肝細胞癌研究中的應用

3.1 肝細胞癌發(fā)病機制研究 PDX模型多用于肝細胞癌的發(fā)病機制等研究。Zhao等[34]對肝細胞癌患者和相關PDX模型中CD133、CD90、CD44等因子的表達進行了定量檢測，并與腫瘤患者和PDX模型的腫瘤和癌旁組織的免疫組化結果進行了驗證。Matsuki等[35]應用2個PDX模型證實了新型分子靶向藥物侖伐替尼具有通過抑制FGF信號通路活性抑制肝細胞癌腫瘤的增殖、轉移及侵襲等作用。Cheung等[36]分別用進展期和非進展期肝細胞癌組織構建肝癌細胞系并建立PDX模型，為肝細胞癌的研究提供模型平臺。Yang等[37]利用PDX模型進行全基因組測序，評價了以JAK1基因為代表的信號通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。Ding等[38]利用PDX模型分析了β-catenin在基因和蛋白水平上的激活狀態(tài)。

3.2 臨床前抗腫瘤藥物療效評估 PDX模型廣泛用于肝細胞癌的臨床前抗腫瘤藥物療效方面的研究，能夠對肝細胞癌的臨床治療提供指導，同時對于新藥的研發(fā)和應用具有很重要的意義。

3.2.1 PDX模型在肝細胞癌信號通路研究中的應用 目前，索拉非尼是抗肝細胞癌的一線藥物，以索拉非尼為代表的分子靶向藥物在進展期肝細胞癌治療中發(fā)揮了重要作用，其抗癌機制是通過抑制多種絲氨酸/蘇氨酸和受體酪氨酸激酶，從而抑制腫瘤血管生成和促進腫瘤細胞凋亡等方面發(fā)揮作用[39]。雖然索拉非尼能夠顯著延長部分肝細胞癌患者的生存期，但還存在未能抑制的信號通路，如磷化硫醇3-激酶/蛋白激酶b信號通路[40]，這些信號通路反過來能夠促進索拉非尼耐藥細胞的生長和存活，從而出現(xiàn)更加難以克服的耐藥現(xiàn)象。研究者利用PDX模型對索拉非尼的抗癌機制以及在抗癌過程中可能會影響其作用的生物標志和信號通路進行了深入的研究，同時也對開發(fā)其他抗肝細胞癌的藥物和成分展開了研究。Wu等[41]通過建立PDX模型證明了利用CDK1抑制劑阻斷CDK1/PDK1/β-Catenin信號通路能夠增強索拉非尼抗腫瘤應答。Wang等[42]利用PDX模型研究發(fā)現(xiàn)抑制胰島素樣生長因子受體1（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R）的活性能夠顯著增強索拉非尼抑制肝癌細胞生長和存活的作用。Liang等[43]應用PDX模型驗證pERK是評價索拉非尼治療肝細胞癌時一項顯著的生物標志物。當索拉非尼通過RAF/MEK/ERK通路發(fā)揮作用時，pERK會出現(xiàn)顯著下調(diào)。Tao等[44]通過構建肝細胞癌PDX模型研究索拉非尼耐藥組與敏感組中DKK1的表達差異，發(fā)現(xiàn)通過降低DKK1表達可增強索拉非尼的敏感性。

3.2.2 PDX模型在肝細胞癌藥物敏感性方面的研究應用 PDX模型因保留患者腫瘤的分子特性和異質(zhì)性，能夠再現(xiàn)患者的藥物敏感性特征，被廣泛應用于肝細胞癌臨床前藥物敏感性研究。Kissel等[21]以瑞戈非尼和索拉非尼為模型藥物，比較了H129小鼠肝癌模型和PDX模型對抗腫瘤藥物的敏感性差異。Lv等[22]利用肝癌細胞系和PDX模型評價了Vc通過SVCT-2對肝細胞癌的抑制作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，PDX模型對抗癌藥物的反應與提供腫瘤樣本的實際患者反應相似[47]。因此，PDX模型有助于測試某些藥物的治療反應，并且可以從異種移植組織獲得治療后數(shù)據(jù)[48]。表2總結了肝細胞癌PDX模型相關研究的文獻資料。另外，我們還注意到，在其他類型腫瘤如肺癌、腸癌等研究中，應用上海立迪生物技術股份有限公司新型開發(fā)的OncoVee?MiniPDX （MiniPDX） 模型進行藥物敏感性試驗，對臨床用藥起到指導性作用[49-50]。MiniPDX模型將患者或PDX來源的腫瘤細胞注入改良的微膠囊和中空纖維培養(yǎng)體系后置入小鼠皮下，其整合了中空纖維和PDX模型的優(yōu)點，將體外分離腫瘤原代細胞與體內(nèi)藥物敏感測試結合起來，可在7 d內(nèi)獲得臨床針對該患者治療藥物敏感性的試驗結果，因此該模型能夠滿足腫瘤晚期或進展期患者治療藥物選擇的迫切需求[51]。但是目前肝癌的MiniPDX模型報道還很少見，可以作為未來研討和深入研究的方向。

表2 肝細胞癌PDX模型相關文獻總結Table 2 Summary of literature on hepatocellular carcinoma PDX models

4 PDX模型相關研究存在的問題

PDX模型是肝細胞癌基礎研究的重要手段之一，目前肝細胞癌PDX模型研究已取得一些進展，但仍存在諸多局限性和挑戰(zhàn)：①與肺癌、胃癌以及乳腺癌等相比，肝細胞癌相關PDX研究報道數(shù)量相對較少，研究不夠深入。②在臨床腫瘤體積很大的情況下，需要病理學家和外科醫(yī)生的協(xié)助選取更合適的腫瘤組織作為后續(xù)研究的標本。③現(xiàn)有的PDX模型多數(shù)是利用肝細胞癌組織標本建立原代細胞系后移植于裸鼠皮下，難以反映腫瘤細胞在肝臟原位的生長情況。④PDX模型的建模周期較長，通常需要2～8個月。⑤部分患者腫瘤的移植成瘤率比較低。⑥免疫缺陷小鼠傳代至3～5代時，原代腫瘤的基質(zhì)成分會被小鼠基質(zhì)所代替。盡管與現(xiàn)有細胞系相比，原代細胞系更加接近和反映患者的個體特性，但在制備PDX的過程中，腫瘤細胞遺傳背景是否能夠保持穩(wěn)定，目前尚無高效、準確以及公認的檢測方法。⑦現(xiàn)有肝臟腫瘤標本的保存策略主要是保存蠟塊和冷凍標本，或凍存原代細胞系，對組織的保存與利用不足。⑧目前應用PDX模型進行肝細胞癌相關藥物敏感檢測的報道仍舊極少。⑨研究成本相對較高，由于免疫缺陷小鼠價格昂貴，腫瘤的形成需要很長的時間，因此開發(fā)PDX模型需要很高的成本。

正因為肝細胞癌PDX模型有上述諸多困難需要克服，其應用并不如其他類型腫瘤PDX模型更加廣泛。但由于其具有獨特性和諸多優(yōu)勢，肝細胞癌PDX模型仍然被認為是一種有價值的臨床前研究工具。

5 總結與展望

綜上所述，盡管肝細胞癌PDX模型存在一些局限性，但該模型在藥物篩選、生物標志物開發(fā)和聯(lián)合臨床試驗等臨床前試驗中具有的優(yōu)勢已經(jīng)越來越顯著。肝細胞癌PDX模型還有利于腫瘤患者個性化藥物的篩選，能夠更好地實現(xiàn)腫瘤的精準醫(yī)療。利用PDX模型為肝細胞癌患者選擇更有效的藥物，既能節(jié)省治療費用，又盡可能提高了患者生存率和生活質(zhì)量。尤其在出現(xiàn)復發(fā)轉移后，還有助于臨床二、三線藥物的選擇[60]。對于肝細胞癌PDX模型缺乏人源化免疫系統(tǒng)的短板，研究者不斷探索將人的造血干細胞移植于X線照射的重度免疫缺陷小鼠，再將患者的腫瘤組織移植于該小鼠形成人源化腫瘤模型[61-62]。此類模型可以很好地模擬人體內(nèi)的生長環(huán)境，多用于研究肝臟腫瘤靶向治療，尤其適用于腫瘤免疫治療方面的研究[63]。目前，研究者應用肝細胞癌PDX模型不斷深入地探索肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的原因，可協(xié)助對肝細胞癌臨床治療提出多樣化和個性化的方案，期待肝細胞癌PDX模型在未來的轉化醫(yī)學和精準醫(yī)療方面能夠發(fā)揮更強的作用。