劉蓓，任良宏

武漢市第六醫(yī)院耳鼻喉科，武漢430000

分泌性中耳炎（SOM）是以中耳積液（MEE）及聽力下降為主要特征的咽鼓管機(jī)械性阻塞和功能障礙性疾病［1］，常見于兒童。目前對于SOM的病因及發(fā)病機(jī)制的研究尚未完善，中耳非化膿性炎性病變、咽鼓管感染及免疫功能異常等都被認(rèn)為與SOM的發(fā)病相關(guān)［2］。SOM早期癥狀不明顯，常導(dǎo)致誤診，晚期發(fā)展為粘連性中耳炎并發(fā)聽力減退等；臨床常采用鼓膜置管術(shù)等進(jìn)行治療，保守治療則采用鼻腔收縮劑、抗生素或口服糖皮質(zhì)激素類藥物［3］。雖然治療方法眾多，但治療過程中患者依從性差，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及藥物不良反應(yīng)較大。巴曲酶是一類降纖類凝血酶原類似物，提取自中南美洲響尾蛇毒液［4］，其對內(nèi)皮細(xì)胞代謝及細(xì)胞因子的表達(dá)有調(diào)控作用，已被普遍用于急性腦梗死、腦缺血及深靜脈血栓等疾病的治療［5］。近年來巴曲酶也用于突發(fā)性耳聾、閉塞性血栓性脈管炎等機(jī)體炎癥的治療［6］，但尚未見巴曲酶治療SOM的相關(guān)報(bào)道。本研究于2019年10月通過建立SOM大鼠模型，探究巴曲酶對SOM大鼠的治療效果及作用機(jī)制，旨在為臨床治療SOM提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（150.0±10.0）g，由江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。巴曲酶注射液購自北京托畢西藥業(yè)有限公司。本研究獲得本院動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)審核（審批號：20190517-06），嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，遵循3R原則。內(nèi)毒素（1 mg/mL，加生理鹽水配置）購自美國Sigma-Aldrich生物公司；生理鹽水購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；白細(xì)胞介素4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；anti-TNF-α及HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 購自 Santa Cruz；TRIzol（Invitrogen）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自日本TAKARA公司；qRT-PCR所用引物委托通用生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。T100型PCR儀購自美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；酶標(biāo)儀購自上海寰熙醫(yī)療器械有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組、模型組、巴曲酶組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間檢測大鼠耳廓靈敏反應(yīng)，顯微鏡下觀察大鼠雙側(cè)鼓膜形態(tài)結(jié)構(gòu)并排除中耳感染。大鼠SOM模型建立參照文獻(xiàn)［7］，0.4%戊巴比妥鈉完全麻醉大鼠（0.1 ml/10 g），固定大鼠，模型組、巴曲酶組經(jīng)右側(cè)中耳用微量注射器（hamilton 80565）注射200 ng/mL內(nèi)毒素溶液50μL，對照組給予相同位置等量生理鹽水注射。造模后光學(xué)顯微鏡下（×50）觀察大鼠鼓膜混濁內(nèi)陷、膨出并分泌積液等作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。造模后隔日開始給予巴曲酶組1.0 BU/kg巴曲酶注射液腹腔注射，同時(shí)對照組、模型組注射等量生理鹽水，每日1次，共14 d。

1.3 MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4檢測及IFN-γ/IL-4計(jì)算 末次給藥后隔日處死大鼠，剝離暴露右耳聽泡，用PBS 50 mL反復(fù)沖洗3次，收集灌洗液，3 000 r/min低速離心10 min（離心半徑13.5 cm），收集灌洗液上清，用ELISA法檢測MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平，并計(jì)算IFN-γ/IL-4。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組樣本設(shè)置8個副本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 中耳黏膜組織病理變化觀察 將聽泡置于濾紙上干燥，于顯微鏡下剝離中耳黏膜組織，加入4%多聚甲醛室溫固定24 h，脫水后浸蠟包埋，上冷凍切片機(jī)制得5μm厚度切片。切片經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后置于光學(xué)顯微鏡（×100）下觀察中耳黏膜組織病理變化。

1.5 中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR。取各組右耳黏膜樣本20 mg，充分剪碎后加入液氮碾磨成粉末，參照TRIzol試劑盒說明書提取組織總RNA。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)核酸定量儀檢測cDNA純度及濃度，取cDNA 100 ng用于qRT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件及參數(shù)：預(yù)變性95℃5 min；擴(kuò)增循環(huán)95℃1 min，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共40次循環(huán)；溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參引物，每組樣品設(shè)置3個副本。GAPDH正向引物5′-CTATGACAGAAACCAGACTCA-3′，反向引物5′-CAGCAGATCAAAGGTGCCGA-3′；TNF-α正向引物 5′-CTGCGCATTTTCCGAGAGATAG-3′，反 向 引物 5′-TGAATTCGTTACAGCTGAGCAG-3′；IFN-γ 正向引物 5′-CCACGCACAGGTTGGAAGCA-3′，反向引物5′-GATTGCGATACAGTATCCTCGC-3′；IL-4正向引物 5′-TGTTCTCGAGTCTGGCTATCA-3′，反向引物 5′-CCGTGATGAGGATGCCCTA-3′。用 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組鼓膜形態(tài)及中耳黏膜病理變化 大鼠鼓膜形態(tài)結(jié)構(gòu)變化：對照組鼓膜結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)正常，未見黏性組織積液分泌，局部呈現(xiàn)規(guī)則放射狀血管紋；模型組耳膜腫脹、局部有明顯內(nèi)陷及組織積液積聚，耳道粘連；巴曲酶組較模型組耳膜腫脹程度明顯減弱，個別大鼠可見積液及氣泡存在，膨出現(xiàn)象顯著減少。大鼠中耳黏膜病理變化：對照組中耳內(nèi)組織上皮排列規(guī)則，纖毛結(jié)構(gòu)正常，黏膜組織無病理變化；模型組中耳內(nèi)組織上皮明顯腫脹，組織間隙紊亂并伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下層肥大細(xì)胞明顯增多，組織結(jié)構(gòu)異常；巴曲酶組中耳內(nèi)組織上皮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯改善，組織炎性浸潤較模型組減輕。

2.2 各組MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平及IFNγ/IL-4比較 與對照組比較，模型組MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平高，IFN-γ/IL-4低（P均＜0.05）。與模型組比較，巴曲酶組MEE中TNF-α水平低、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4高（P均＜0.05）；而兩組MEE中IL-4水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平比較（-x± s）

2.3 各組中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)比較 與對照組比較，模型組中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)高（P均＜0.05）。與模型組比較，巴曲酶組中耳黏膜組織中TNF-αmRNA表達(dá)低，IFN-γmRNA表達(dá)高（P均＜0.05）；而兩組中耳黏膜組織中IL-4 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)比較（-x± s）

3 討論

中耳炎是多種原因引起的中耳全部或部分結(jié)構(gòu)炎癥性病變，臨床主要分為化膿性和非化膿性中耳炎。其中非化膿性中耳炎又分為SOM及氣壓損傷性中耳炎。近年來研究認(rèn)為，SOM是臨床中常見的導(dǎo)致兒童聽力損傷及語言功能障礙的疾病，同時(shí)慢性鼻竇炎等多種機(jī)械性阻塞、細(xì)菌病毒感染引起的功能性通氣障礙等疾病是SOM發(fā)病的主要原因。

近年來越來越多的學(xué)者對SOM的病因及發(fā)病機(jī)制提出了假說，其中“中耳負(fù)壓學(xué)說”“免疫學(xué)說”“Th1/Th2失衡假說”等尤為受到關(guān)注［8-10］。相應(yīng)的，黏蛋白、細(xì)胞因子及自身免疫調(diào)節(jié)等靶向不同機(jī)制的治療手段成為現(xiàn)階段治療SOM的研究熱點(diǎn)。而巴曲酶作為一種可能的免疫調(diào)節(jié)因子對SOM發(fā)生過程中的分子調(diào)控和炎癥抑制機(jī)制未見研究。本研究通過構(gòu)建大鼠SOM模型，首次探究了其對包括TNF-α在內(nèi)的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，為闡明巴曲酶治療SOM的機(jī)制提供依據(jù)。

本研究通過采用中耳注射內(nèi)毒素溶液法建立分泌性中耳炎大鼠模型，研究巴曲酶對于分泌性中耳炎大鼠的作用及機(jī)制。首先通過耳鏡觀察大鼠鼓膜外部形態(tài)及組織切片HE染色表征巴曲酶對SOM大鼠的治療作用，結(jié)果顯示巴曲酶能夠顯著抑制中耳黏膜組織炎性細(xì)胞浸潤、改善模型大鼠耳膜腫脹及組織積液分泌異常等病理變化，同時(shí)結(jié)果顯示巴曲酶能夠?qū)χ卸M織上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)起到一定的治療作用，提示巴曲酶能夠顯著改善SOM大鼠中耳組織病理改變，抑制組織結(jié)構(gòu)病理性進(jìn)展，進(jìn)而發(fā)揮對SOM的治療作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α參與分泌性中耳炎的疾病進(jìn)展。李欣等［11］臨床研究表明，TNF-α參與SOM發(fā)病及遷延過程，并與MEE的清除有關(guān)；曾祥悅等［12］通過研究發(fā)現(xiàn)，SOM模型豚鼠耳泡灌洗液TNF-α水平及中耳黏膜TNF-α表達(dá)均顯著升高，通過抑制TNF-α表達(dá)則能夠減輕黏膜厚度和中性粒細(xì)胞浸潤程度，進(jìn)而改善SOM疾病進(jìn)展，可見TNF-α在SOM進(jìn)展及疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究通過ELISA檢測炎性因子TNF-α表達(dá)，結(jié)果表明，與對照組比較，模型組MEE及中耳黏膜組織TNF-α表達(dá)高；與模型組比較，巴曲酶組MEE及中耳黏膜組織TNF-α表達(dá)低。提示巴曲酶能夠通過調(diào)控TNF-α表達(dá)抑制中耳上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，調(diào)控胞質(zhì)及組織間隙炎性細(xì)胞分泌，發(fā)揮對SOM炎癥的抑制作用。

“Th1/Th2失衡假說”認(rèn)為，Th1和Th2細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞激活后的兩種效應(yīng)細(xì)胞，二者在機(jī)體內(nèi)的動態(tài)平衡共同維系著機(jī)體的免疫系統(tǒng)［13］，而IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平則分別代表著兩種細(xì)胞在體內(nèi)的活化狀態(tài)［14］。前期研究表明，中耳在受到各種局部刺激后體內(nèi)會發(fā)生Th細(xì)胞的分化偏移［15］，這種偏移會導(dǎo)致黏膜上皮損傷和組織積液產(chǎn)生［16］，進(jìn)而誘導(dǎo)并加重SOM的發(fā)生發(fā)展。所以在SOM的治療過程中，對于IFN-γ和IL-4水平的調(diào)控是SOM能夠得到有效控制的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組MEE中IFN-γ、IL-4水平高，而IFN-γ/IL-4卻呈現(xiàn)降低趨勢，給予巴曲酶注射治療后IFN-γ表達(dá)持續(xù)增加，與模型組存在顯著性差異，IL-4表達(dá)趨于穩(wěn)定，與模型組間無差異。巴曲酶組IFN-γ/IL-4值較模型組顯著升高，同時(shí)IFN-γ、IL-4 mRNA的表達(dá)變化也與上述檢測結(jié)果一致。提示在SOM的發(fā)病早期會促進(jìn)體內(nèi)IFN-γ的表達(dá)，而IFN-γ表達(dá)增加則進(jìn)一步促進(jìn)了巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)而激活細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生，但給予SOM大鼠巴曲酶后其組織病理變化緩解的同時(shí)IFN-γ水平則進(jìn)一步升高。這表明早期SOM發(fā)病過程中IFN-γ水平的略微升高反而會刺激炎癥進(jìn)一步加劇，而給予大鼠巴曲酶后能夠促進(jìn)IFN-γ水平進(jìn)一步升高至能夠發(fā)揮炎癥抑制作用的水平，進(jìn)而激活機(jī)體對炎癥細(xì)胞分泌的抑制作用；同時(shí)巴曲酶對IL-4分泌的抑制作用則提示巴曲酶可能通過抑制Th2細(xì)胞激活介導(dǎo)的Ⅰ型自身免疫反應(yīng)，進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞分泌、浸潤及積聚。

綜上所述，本研究首次證明了巴曲酶對SOM大鼠具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α表達(dá)并調(diào)控IFN-γ/IL-4失衡有關(guān)，對SOM的治療有一定的參考意義。