陳訓(xùn)春，李名蘭，潘碧云，王燕英

(?？谑腥嗣襻t(yī)院，海南 ?？?570208)

非特異性刺激導(dǎo)致的氣道狹窄是呼吸系統(tǒng)阻塞性疾病，支氣管哮喘特征之一。雖然其病理生理學(xué)機(jī)制還不十分清楚，現(xiàn)在已經(jīng)提出了幾種機(jī)制來(lái)解釋氣道高反應(yīng)性(Airway hyperresponsiveness，AHR)，包括控制氣道平滑肌的神經(jīng)系統(tǒng)的改變[1]，氣道黏膜分泌物的增加[2]，以及與氣道重塑有關(guān)的機(jī)械因素等[3]。此外，還有研究人員認(rèn)為導(dǎo)致哮喘患者氣道狹窄與氣道平滑肌異常有關(guān)[4-5]。通過(guò)吸入β-受體興奮劑來(lái)快速緩解哮喘癥狀也提示氣道平滑肌收縮可能參與了哮喘患者的氣道阻塞。因此，研究在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中與氣道平滑肌收縮有關(guān)的分子非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌收縮主要受細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。最近，另一種稱為Ca2+致敏的機(jī)制被認(rèn)為與激動(dòng)劑引起的平滑肌收縮有關(guān)[6-7]。有研究結(jié)果顯示，雖然詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，有增加證據(jù)表明單體GTP結(jié)合蛋白R(shí)hoA及其下游分子Rho激酶參與Ca2+致敏機(jī)制[6-7]。當(dāng)RhoA/Rho激酶系統(tǒng)被激動(dòng)劑激活后，肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain，MLC)磷酸酶水平降低，MLC磷酸化水平增加，導(dǎo)致平滑肌收縮增加。最近的研究顯示，一些疾病患者的平滑肌中RhoA/Rho激酶系統(tǒng)介導(dǎo)的Ca2+致敏機(jī)制增加，包括冠心病[8]、感染性休克[9]和高血壓[10]。但是，有關(guān)RhoA/Rho激酶系統(tǒng)在支氣管哮喘中的作用卻少有研究。白芥子散以白芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛、麻黃按 2∶2∶1∶1∶1 比例混合，具有辛溫散寒、化痰通絡(luò)、溫陽(yáng)益氣的功效。臨床上用于治療咳嗽、慢性支氣管炎等疾病[11-12]。但是，關(guān)于其在支氣管哮喘中的作用卻少有研究。本研究旨在探討白芥子散對(duì)哮喘大鼠免疫穩(wěn)態(tài)重建及其對(duì)于RhoA基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Wistar大鼠(6周齡，SPF級(jí)，雄性)，體重170～190 g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前1周開(kāi)始飼養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，平均溫度(25±2)℃，無(wú)卵蛋白飲食，每天12 h自然光光照，12 h無(wú)光照。

1.2 分組與造模方法 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將60只Wistar大鼠分為六組，A組(正常對(duì)照組)、B組(陰性對(duì)照組)、C組(哮喘模型組)、D組(地塞米松組)、E組(白芥子散2 h組)和F組(白芥子散4 h組)，每組10只。除A組和B組外，其他所有組均根據(jù)改良的Palmans方法建立哮喘模型[13]。在第1天和第8天通過(guò)皮下注射1 ml含10 mg OVA和100 mg Al(OH)3的生理鹽水懸浮液使每只模型大鼠致敏(B組注射1 ml生理鹽水)。 15 d后，將它們放置在透明的玻璃箱中，每隔30 min 1次，每隔1 d使用1% OVA生理鹽水溶液刺激哮喘(B組用生理鹽水霧化)。直到第56天霧化結(jié)束。在上一次氣溶膠觀察模型后，模型出現(xiàn)打噴嚏、明顯的腹部呼吸、無(wú)力、鼻癢、抓撓和反應(yīng)緩慢等癥狀時(shí)，認(rèn)為造模成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 在第56天，建立所有模型后，正常喂養(yǎng)大鼠14 d，等待它們進(jìn)入緩解期。 第15天開(kāi)始集體治療。 A組和B組正常進(jìn)食；C組隔天腹腔注射地塞米松，每次0.5 mg/kg。 將D組大鼠的背部剃光，并在肺俞、脾俞和腎俞的兩側(cè)(定位參見(jiàn)“實(shí)驗(yàn)性針灸法”[14])應(yīng)用0.8 cm×0.8 cm的白芥子散膏藥，用膠帶固定，分別在2 h和4 h后取下，每?jī)商熘委?次，共7次。

1.4 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)麻醉，仰臥位固定，右腹股溝處取動(dòng)脈血至采血管中，置管30 min，3000 r/min離心，提取血清分裝入凍存管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。沿胸部正中線暴露大鼠胸腔，取右肺中葉置于10%甲醛溶液固定備用。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 HE染色：右肺中葉常規(guī)石蠟包埋、切片。常規(guī)HE染色。炎性細(xì)胞是指氣管周圍及肺組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，染為藍(lán)色。

1.5.2 ELISA檢測(cè)：酶標(biāo)儀采用HBS-1096C Pro自動(dòng)酶標(biāo)儀(上?？茟褍x器有限公司)，TNF-α和IL-6的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒由北京普爾韋耶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的嚴(yán)格操作，通過(guò)ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的水平。

1.5.3 Western blot檢測(cè)：收集細(xì)胞。 用PBS緩沖液沖洗，添加RIPA裂解緩沖液，并在冰浴條件下攪拌30 min以提取總細(xì)胞蛋白。 離心15min(15000 r/min)后，通過(guò)BAC方法測(cè)量細(xì)胞總蛋白，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移并標(biāo)記蛋白，洗脫TBS顯色，通過(guò)UVP凝膠收集圖像，并讀取Western條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用組間t檢驗(yàn)分析。計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺泡組織HE染色 如圖1所示，A組和B組肺泡結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有炎癥和水腫的表現(xiàn)(圖1A和1B)。 C組肺泡結(jié)構(gòu)破壞顯著，表現(xiàn)出肺水腫，肺泡塌陷和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)。采用地塞米松和白芥子散治療2 h和4 h后肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減輕(圖1D-F)。

A：正常對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：哮喘模型組；D：地塞米松組；E：白芥子散2 h組；F：白芥子散4 h組

2.2 各組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比較，哮喘模型組支氣管肺泡灌洗液中的總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量均顯著增加(均P<0.05)。 地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了支氣管肺泡灌洗液中的總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。

表1 各組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)(×108/L)

2.3 各組支氣管肺泡灌洗液內(nèi)TNF-α和IL-6水平比較 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組相比較，哮喘模型組支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6水平均顯著增加(均P<0.05)。 地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6水平。

表2 各組支氣管肺泡灌洗液內(nèi)TNF-α和IL-6水平比較

2.4 各組肺組織中RhoA表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組肺組織中RhoA表達(dá)顯著增加。地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了肺組織中的RhoA表達(dá)水平(圖2)。

圖2 肺組織中RhoA表達(dá)水平

3 討 論

以往研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的AHR與氣道平滑肌異常相關(guān)[4-5]。平滑肌是氣道的主要組織結(jié)構(gòu)，并且在氣道收縮中發(fā)揮了重要的作用。氣道平滑肌的過(guò)度收縮可能是引起哮喘癥狀，例如AHR的直接關(guān)鍵因素之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)敏性支氣管哮喘大鼠模型中，激動(dòng)劑誘導(dǎo)的RhoA介導(dǎo)的Ca2+致敏性氣道平滑肌收縮伴有RhoA蛋白表達(dá)水平的增加[16]。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吸入激動(dòng)劑如Ach和神經(jīng)激肽A也會(huì)導(dǎo)致AHR的發(fā)生。類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，包括體內(nèi)AHR、支氣管平滑肌高反應(yīng)性，以及RhoA介導(dǎo)的Ca2+致敏性氣道平滑肌收縮在卵清蛋白抗原誘導(dǎo)的支氣管哮喘大鼠模型中得到了證實(shí)。RhoA及其下游分子Rho激酶在人支氣管平滑肌收縮中的重要性也得到了驗(yàn)證。因此，現(xiàn)在已經(jīng)有科學(xué)家提出RhoA/Rho激酶途徑可以作為治療哮喘的新靶點(diǎn)[17]。

白芥子散中的白芥子辛溫、利氣、豁痰、寬胸；細(xì)辛祛風(fēng)散寒、溫肺化飲；甘遂逐水利腸、宣通肺氣；延胡索行氣活血；鮮姜汁辛溫、歸肺經(jīng)、溫肺散寒、利氣豁痰、止咳平喘；麻黃宣肺、散寒、平喘。貼敷的穴位以背俞穴為主，而在背為陽(yáng)，背俞穴又是五臟六腑之氣輸注和匯聚的部位，故藥物敷貼產(chǎn)生的藥力和熱力可通過(guò)穴位的刺激作用，促進(jìn)臟腑功能活動(dòng)的良性運(yùn)轉(zhuǎn)。如《難經(jīng)·六十七難》所言：“陰病行陽(yáng)，陽(yáng)病行陰。故令募在陰，俞在陽(yáng)”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為：穴位給藥的生物利用度明顯高于一般給藥，因腧穴對(duì)藥物具有敏感性和放大效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組肺組織中RhoA蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加。這是與以往的研究結(jié)果相一致的[16]。而地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了肺組織中RhoA蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，提示白芥子散可能是通過(guò)抑制RhoA基因蛋白質(zhì)的表達(dá)而抑制支氣管平滑肌收縮，從而改善哮喘癥狀。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，白芥子散治療方法可以減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞數(shù)量均明顯減少。其機(jī)制可能是炎癥細(xì)胞，例如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移需要肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重塑，而單體GTP結(jié)合蛋白R(shí)hoA、Rac1和Cdc42是肌動(dòng)蛋白重組的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[18]。因此，白芥子散可能是通過(guò)抑制RhoA的表達(dá)而抑制了炎癥細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)。

研究發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平增加出現(xiàn)在支氣管哮喘的早期階段。在各種促炎細(xì)胞因子中，已報(bào)道TNF-α和IL-6在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卵清蛋白抗原注射后，TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化增強(qiáng)，導(dǎo)致TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，并且這兩種細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)也會(huì)激活NF-κB[20]。這種正反饋可以放大原先的炎癥反應(yīng)，并在卵清蛋白抗原誘導(dǎo)的支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。在本研究中，白芥子散治療方法可以減少支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6水平，其機(jī)制可能與白芥子散下調(diào)活化的NF-κB，從而阻止了促炎細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)并限制炎癥反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，白芥子散可改善抗原誘導(dǎo)的大鼠哮喘，幫助其免疫穩(wěn)態(tài)的重建，其作用機(jī)制可能是通過(guò)減少RhoA基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。