孫宇軒 唐曉敏 徐晨宇 郭小濤 趙軼 梁越 潘春晨 孫家強(qiáng) 孫敬武

氯化鋰(lithium chloride, LiCl)在臨床上常用于治療雙向情感障礙[1]。氯化鋰治療劑量和中毒劑量的安全范圍小，具有明顯的神經(jīng)毒性、腎毒性和生殖毒性[2,3]。在人體內(nèi)，嚴(yán)重的氯化鋰中毒可引起明顯的不可逆性聽力損失[4]。近期有研究表明，氯化鋰可以激活腦組織中c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5,6]。但有關(guān)氯化鋰對內(nèi)耳影響的研究目前甚少，尚不清楚氯化鋰是否能通過JNK信號通路對耳蝸毛細(xì)胞造成損傷，從而造成聽力損失。故本研究擬通過建立體外HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的氯化鋰損傷模型，探討氯化鋰對HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) HEI-OC1(House Ear Institute-organ of Corti 1)小鼠耳蝸毛細(xì)胞樣細(xì)胞株由美國House耳科研究所提供。將細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖液體培養(yǎng)基(Gibco，美國)中，在33℃、含10% CO2空氣的條件下采用TC處理后的六孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔細(xì)胞1×106個/mL，每2～3天換液，當(dāng)細(xì)胞密度接近80%時(shí)傳代。

1.2CCK-8檢測氯化鋰對HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的抑制并計(jì)算IC50值 采用CCK-8試劑盒(生工公司，中國)對細(xì)胞進(jìn)行檢測。HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以5×104個/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔含100 μL完全培養(yǎng)基。在33℃、含10%CO2的空氣條件下培養(yǎng)過夜后，分組加入氯化鋰，濃度分別為0、25、50、75、100、125、150 mM；繼續(xù)在33℃、含10%CO2空氣的條件下培養(yǎng)。分別在12、24、48、72小時(shí)分別加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2小時(shí)后采用酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，美國)設(shè)定在450 nm處檢測每孔的吸光度值，每個樣本至少有三個重復(fù)，根據(jù)吸光度值繪制各組細(xì)胞的抑制曲線，根據(jù)擬合曲線計(jì)算出氯化鋰24小時(shí)的IC50值。

1.3氯化鋰誘導(dǎo)小鼠HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞毒性模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 取經(jīng)上述培養(yǎng)后處于對數(shù)生長期的HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞分為對照組、實(shí)驗(yàn)組、DMSO組、JNK抑制組。對照組不進(jìn)行任何干預(yù)，僅在含10%胎牛血清的DMEM高糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)；實(shí)驗(yàn)組加入含有IC50濃度氯化鋰(Sigma，美國，8M)和10%胎牛血清DMEM高糖液體培養(yǎng)基干預(yù)24小時(shí)；DMSO組(溶劑組)和JNK抑制組分別加入0.1%(v/v)DMSO(生工公司，中國)和20 μM SP600125(碧云天，中國)預(yù)處理2小時(shí)后，再加入含有IC50濃度氯化鋰(Sigma，美國，8M)的含10%胎牛血清DMEM高糖液體培養(yǎng)基干預(yù)24小時(shí)；這兩組僅進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證氯化鋰是否通過JNK信號道路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.4TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將各組HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)于爬片上，用4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS清洗兩次，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘，PBS清洗兩次，加入TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘，DAPI復(fù)染樣品5分鐘，倒置熒光顯微鏡成像(徠卡，德國)。對每個視野下TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)得出各組細(xì)胞凋亡率。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取經(jīng)上述分組干預(yù)后的HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞，通過使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(BD，美國)檢測細(xì)胞凋亡率。在室溫下，在含有飽和濃度的Annexin V-FITC和碘化丙錠(PI)的結(jié)合緩沖液中染色細(xì)胞15分鐘，使Annexin V-FITC的特異性結(jié)合發(fā)生。通過流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國)分析細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞計(jì)數(shù)10 000個。

1.6反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、JNK、BAX、Bcl-2 mRNA表達(dá) 取經(jīng)上述分組干預(yù)后的HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞用RNAiso Plus(Takara bio，日本)從預(yù)處理的HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞中提取總RNA，用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒(Takara bio，日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(Takara bio，日本)進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物公司合成，各基因的引物見表1。

表1 RT-PCR使用的引物序列

1.7免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、JNK、p-JNK、BAX、Bcl-2蛋白表達(dá) 取經(jīng)上述分組干預(yù)后的HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞，消化收集并加入RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，4℃ 12 000 rpm離心15分鐘，取上清液用BCA試劑盒(碧云天，中國)測定蛋白質(zhì)濃度。稀釋到合適濃度后，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1小時(shí)。使用ECL發(fā)光液(碧云天，中國)曝光，以GAPDH(1∶1000，CST，美國)為內(nèi)參，分別測算Cleaved-Caspase-3(1∶1000，CST,美國)、Cleaved-Caspase-9(1∶1000，CST,美國)、JNK(1∶2000，CST，美國)、p-JNK(1∶2000，CST，美國)、BAX(1∶1000，CST，美國)、Bcl-2(1∶1000，CST，美國)的灰度值，并計(jì)算相對表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均來自每組三個以上的重復(fù)樣本，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用t檢驗(yàn)和單向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1CCK-8檢測細(xì)胞抑制結(jié)果 氯化鋰對HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞抑制作用見圖1，抑制率與藥物作用時(shí)間、濃度呈正相關(guān)(P<0.01)。擬合出氯化鋰在24小時(shí)的IC50值為69.53 mM，故實(shí)驗(yàn)組采用的氯化鋰濃度約為24小時(shí)IC50值70 mM。

圖1 CCK-8檢測不同濃度和作用時(shí)間氯化鋰對HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的抑制率

2.2TUNEL檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 對照組和實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過不同干預(yù)處理后的HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的TUNEL熒光染色如圖2，并對TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組凋亡率(36.00%±2.65%)明顯高于對照組(2.33%±0.58%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.53,P<0.01)。

圖2 免疫熒光染色顯示HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞中TUNEL的表達(dá)(×200) 藍(lán)色熒光為DAPI，紅色熒光為TUNEL

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 如圖3所示，與對照組(0.42%±0.02%)相比，實(shí)驗(yàn)組的HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的早期凋亡率明顯增加至42.40%±0.82%。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=88.33,P<0.01)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡

2.4RT-PCR結(jié)果 由表2可見，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3、Caspase-9、JNK、BAX mRNA表達(dá)增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 RT-PCR檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組Caspase-3、Caspase-9、JNK、BAX、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量

2.5Western blot結(jié)果 由表3、圖4可見，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、p-JNK、BAX蛋白表達(dá)增加，Bcl-2、Bcl-2/BAX蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與實(shí)驗(yàn)組相比，DMSO組各蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與實(shí)驗(yàn)組相比，JNK抑制組Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、p-JNK、BAX蛋白表達(dá)減少，Bcl-2、Bcl-2/BAX蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測各組HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、JNK、P-JNK、BAX、Bcl-2、GAPDH蛋白條帶

表3 Western blot檢測各組Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、p-JNK、BAX、Bcl-2、Bcl-2/BAX蛋白相對表達(dá)量

3 討論

氯化鋰作為一種治療劑量和中毒劑量的安全范圍較小的臨床一線藥物，在血清中的濃度高時(shí)，對多器官的潛在毒性作用一直是臨床使用氯化鋰的一大障礙[7]。有研究(Donaldson,1981)稱氯化鋰中毒可以引起聽力損失，然而目前尚不清楚氯化鋰通過何種方式造成了聽力損失。為了探究這一問題，本研究首先建立了HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的氯化鋰損傷模型，并發(fā)現(xiàn)氯化鋰對細(xì)胞的抑制率與作用時(shí)間、濃度呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)(侯永根，2003)報(bào)道一致。近期有研究表明，氯化鋰可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6,8]，本研究中，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，說明氯化鋰確實(shí)可以引起HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡率增高。有研究表明，氯化鋰可以激活腦組織中JNK的表達(dá)[5]，提示氯化鋰可能通過JNK通路誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。JNK是一種屬于哺乳動物絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的絲氨酸/蘇氨酸激酶[9]，JNK在死亡受體啟動的外源性和線粒體內(nèi)源性凋亡通路中發(fā)揮重要作用[10]；JNK通過直接磷酸化可以抑制Bcl-2的表達(dá)，并促進(jìn)Bad和Bax的活化，活化的Bax和Bad誘導(dǎo)線粒體外膜的通透性，從而使細(xì)胞色素C從線粒體膜間隙釋放，釋放的細(xì)胞色素C與Apaf-1和Caspase-9結(jié)合形成凋亡小體，繼而觸發(fā)Caspase-9級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3和Caspase-7，引起細(xì)胞凋亡[11]。在本研究中，RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說明氯化鋰增加了p-JNK、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、BAX的表達(dá)，減少了Bcl-2、Bcl-2/BAX的表達(dá)，表明氯化鋰可能通過JNK通路誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。為了進(jìn)一步驗(yàn)證氯化鋰是否通過JNK信號通路誘導(dǎo)凋亡，本研究使用JNK抑制劑SP600125對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JNK抑制組JNK的磷酸化受到抑制，p-JNK、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、BAX表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組減少，Bcl-2、Bcl-2/BAX表達(dá)增加，進(jìn)一步證明了氯化鋰通過JNK信號通路誘導(dǎo)了HEI-OC1細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，氯化鋰可以誘導(dǎo)HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能為通過JNK通路相關(guān)的線粒體凋亡途徑，并對Caspase-3、Bcl-2也具有調(diào)控作用。然而，本研究具有一定局限性，僅使用HEI-OC1毛細(xì)胞樣細(xì)胞建立體外氯化鋰損傷模型，但氯化鋰在動物體內(nèi)的劑量濃度、代謝效率與體外存在差距，故氯化鋰損傷毛細(xì)胞的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。