賈哲 張珂 黃容海 赫嶸 魯巖 蔣力

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤。盡管肝細(xì)胞癌的治療不斷進(jìn)展，但復(fù)發(fā)及晚期患者的預(yù)后仍不理想。目前已有多種免疫療法應(yīng)用于肝癌治療，但效果并不理想[1]。腫瘤的免疫反應(yīng)是由腫瘤組織的抗原性和腫瘤組織的微環(huán)境之間的平衡決定的[2]。在中國，肝癌主要是通過慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝炎肝硬化發(fā)展而來，往往此類患者因門靜脈高壓同時合并脾大及脾功能亢進(jìn)。無論病毒性肝炎、肝硬化、脾功能亢進(jìn)還是腫瘤都共同導(dǎo)致了患者體內(nèi)的免疫內(nèi)環(huán)境紊亂[3]。本文對此類患者外周血及肝、脾的細(xì)胞免疫情況進(jìn)行了深入研究。

資料與方法

一、研究對象

選擇2018年1月至2019年6月間就診首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院普外科的原發(fā)性肝癌同時合并脾功能亢進(jìn)，同期行肝癌肝部分切除聯(lián)合脾切除術(shù)的27名患者為研究對象(實驗組)。納入標(biāo)準(zhǔn)為，年齡≤65歲，皆為乙肝肝硬化；肝癌為首次發(fā)現(xiàn)，未接受其他任何手術(shù)及靶向、免疫等治療；腫瘤為單發(fā)，直徑≤5 cm；術(shù)前檢查提示脾大，重度脾功能亢進(jìn)(外周血中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板兩系或三系重度減少)；近期未發(fā)生消化道出血，胃鏡檢查未提示食道胃底靜脈的重度曲張，未提示紅色征或藍(lán)色征陽性；肝功能Child分級為A-B級，無嚴(yán)重心肺腎及代謝性疾病。另選擇同期于我院健康體檢的患者20例抽取外周血作為對照組1，因肝血管瘤行手術(shù)治療的患者13例留取正常肝組織為對照組2，因脾外傷行脾切除術(shù)的患者7例留取正常脾臟組織作為對照組3。

二、組織標(biāo)本的獲取

外周血標(biāo)本檢測：研究組患者于術(shù)前及對照組1健康人群留取外周血，并于即刻流式細(xì)胞儀測定CD4+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞比例、CD8+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞比例、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值。

腫瘤及肝組織標(biāo)本的獲?。簩嶒灲M術(shù)中切除肝臟腫瘤標(biāo)本后，立刻無菌留取腫瘤及瘤旁5 mm外肝組織；對照組2行肝血管瘤切除術(shù)后，據(jù)血管瘤外5 mm留取肝組織。獲取標(biāo)本并制作石蠟標(biāo)本留存，并收集所有標(biāo)本后統(tǒng)一行免疫組化測定，考察兩組標(biāo)本中CD4、CD8、TGF-β1、Foxp3、Granzyme B的蛋白表達(dá)情況。

脾臟組織標(biāo)本的獲?。貉芯拷M與對照組3術(shù)中切除脾臟后，立刻留取完整的脾臟組織標(biāo)本。獲取脾臟組織標(biāo)本后，同樣制作石蠟標(biāo)本留存，并收集所有標(biāo)本后統(tǒng)一行免疫組化測定，考察兩組標(biāo)本中CD4、CD8、TGF-β1、Foxp3、Granzyme B的蛋白表達(dá)情況。

三、實驗方法

(一)流式細(xì)胞術(shù) 實驗組及對照組1的患者分別進(jìn)行外周血樣采集。采用FACS CantoII流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)及熒光標(biāo)記的單克隆抗體FITC anti-human CD4、APC anti-human CD8(美國BioLegend公司)對各血樣中的淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，其中淋巴細(xì)胞亞群檢測指標(biāo)包括CD4+、CD8+，提取數(shù)據(jù)后計算CD4+/CD8+比值，并比較組間淋巴細(xì)胞亞群情況。

(二)免疫組化 免疫組化檢測肝、脾石蠟樣本中CD4、CD8、TGF-β1、Foxp3、Granzyme B的蛋白表達(dá)情況。一抗使用TGF-β抗體(Abcam，ab215715；1:500)、Foxp3抗體(Abcam，ab22510；1:500)、Granzyme B抗體(Abcam ab134993；1:250)、CD4抗體 Abcam(ab133616；1:5000)、CD8抗體 (Abcam ab93278；1:1000)；二抗選擇抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(Proteintech,KIHC-5)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

流式細(xì)胞檢測結(jié)果以CellQuest軟件分析。免疫組化切片用奧林巴斯自動顯微照相裝置進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)拍攝5個高倍鏡(10×40)視野，取5個視野的平均值加以比較；采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量蛋白陽性表達(dá)的累積光密度(integrated optical density，IOD)及平均光密度(average optical density,AOD)進(jìn)行比較。統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件。對于兩獨立樣本間的比較，先行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)，采用t檢驗比較連續(xù)變量間的差異，相應(yīng)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；對不符合的數(shù)據(jù)，采用Mann-WhitneyU檢驗進(jìn)行比較，相應(yīng)數(shù)據(jù)以中位數(shù)(極差)表示。

結(jié) 果

一、患者基本情況

表1總結(jié)了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院普外科病區(qū)2018年1月至2019年6月間收治的27例原發(fā)性肝癌同時合并脾功能亢進(jìn)患者。行肝部分切除術(shù)明確腫瘤性質(zhì)，改善患者生存時間及生存質(zhì)量；同期行脾切除及賁門周圍血管離斷術(shù)目的是治療脾功能亢進(jìn)引起的白細(xì)胞及血小板減少癥，并預(yù)防上消化道出血的再次發(fā)生。20名健康體檢者為外周血正常情況的對照組1，13名肝血管瘤行手術(shù)治療的患者作為正常肝組織的對照組2，11例脾外傷的患者作為正常脾臟組織的對照組3。所有對照組患者均未罹患各類傳染性疾病及肝脾相關(guān)疾病。所有樣本均在獲得患者知情同意后進(jìn)行研究，并獲得了倫理審查委員會的許可。

表1 各組患者的基本情況

二、實驗組及對照組1外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較

利用流式細(xì)胞術(shù)，我們測量并比較了實驗組及對照組1外周血T細(xì)胞亞群的情況。從圖1可見肝癌合并肝硬化脾亢患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞百分比以及CD4+/CD8+T細(xì)胞比例較正常人群明顯下降，但CD8+T淋巴細(xì)胞百分比則較正常人群升高。并根據(jù)表2結(jié)果可見兩組比較具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 實驗組及對照組1外周血采用流式細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)，評估CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞情況

表2 實驗組及對照組1外周血T細(xì)胞亞群的比較

三、實驗組同正常肝、脾組織免疫狀況的比較

利用免疫組化方法，筆者對肝硬化脾功能亢進(jìn)合并肝癌患者同健康人群比較，分析此類人群于肝臟及脾臟組織局部的免疫狀況改變。如圖2所示，免疫組化檢測結(jié)果顯示Foxp3主要定位于細(xì)胞核，染色呈棕黃色。對照組2健康人的肝組織中幾乎沒有Foxp3的表達(dá)(IOD值為3 232.150±1 452.071)，而慢性肝炎、肝硬化患者的肝組織中其表達(dá)則顯著上升。在肝癌和癌旁的肝組織內(nèi)的Foxp3表達(dá)的T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)出彌散分布狀況，而在匯管區(qū)的Foxp3表達(dá)的T淋巴細(xì)胞，鏡下可觀察到明顯的集中分布趨勢，不但平均光密度值明顯增加(圖3，P<0.01)，而且累積光密度IOD值更為明顯增加(15 015.298±5 361.053，P<0.01)，說明Foxp3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及可表達(dá)Foxp3的細(xì)胞明顯增加；在脾臟Foxp3表達(dá)主要集中在邊緣區(qū)，脾小體周圍及動脈淋巴鞘區(qū)亦有少量表達(dá)。門靜脈高壓癥脾功能亢進(jìn)患者脾臟組織中的Foxp3表達(dá)量(AOD值為0.257±0.017)比對照組正常脾臟(0.269±0.016)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)無明顯變化P>0.05。

圖2 免疫組化檢測兩組患者肝、脾樣本中TGF-β1、Foxp3、Granzyme B 、CD4、CD8的蛋白表達(dá)情況

圖3 同健康人群比較，肝硬化肝癌患者肝、脾樣本中TGF-β1、Foxp3、Granzyme B 、CD4、CD8的蛋白表達(dá)情況

Granzyme B于免疫組化下以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀信號為陽性細(xì)胞。由此可見Granzyme B于肝臟內(nèi)無密集趨勢，均勻散布于正常肝竇、癌組織中，所以筆者以平均光密度值對組織內(nèi)蛋白表達(dá)量的多少加以表示。Granzyme B在肝癌組織中的表達(dá)量(AOD值為0.075±0.015)高于癌旁(0.059±0.014)及正常肝組織(0.058±0.032)，P<0.05。于癌旁及正常肝組織內(nèi)表達(dá)量無明顯差異；在脾臟Granzyme B廣泛表達(dá)于邊緣區(qū)及紅髓，于脾功能亢進(jìn)時Granzyme B 在脾臟的AOD為0.119±0.034，較正常脾臟組織(0.084±0.027)表達(dá)明顯增多(P<0.01)。

TGF-β1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中也可見少量表達(dá)。其染色為棕褐色的為陽性細(xì)胞。在免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果可見TGF-β1蛋白在肝癌組織中(AOD值為0.074± 0.017)存在要少于癌旁肝組織(0.084±0.011)及正常肝臟組織(0.091±0.023)；在脾臟TGF-β1分布情況基本同Granzyme B，正常脾臟表達(dá)TGF-β1蛋白的AOD值為0.083±0.012，也是于脾功能亢進(jìn)時明顯增多(0.094±0.016)。

CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞在肝臟中主要表達(dá)于匯管區(qū)，于肝臟組織內(nèi)基本沒有表達(dá)。與正常肝臟相比，肝硬化肝癌患者腫瘤及癌旁CD4蛋白表達(dá)的平均光密度值無明顯差異，但可見正常肝臟的累積光密度值IOD(1192.511±348.434)較肝癌組織(36.574±21.262)存在非常明顯的差異(P<0.01)，說明CD4+細(xì)胞的數(shù)量在正常肝組織要明顯多于肝癌及癌旁組織。同樣，與正常肝臟相比，肝硬化肝癌患者腫瘤及癌旁CD8蛋白表達(dá)的平均光密度值及累計光密度值均明顯升高(P<0.05)；在脾臟T淋巴細(xì)胞主要分布于脾臟白髓的動脈周圍淋巴鞘以及白髓、紅髓交界處的邊緣區(qū)。正常及脾功能亢進(jìn)時患者脾臟內(nèi)CD4蛋白表達(dá)的平均光密度值基本相同，但累積光密度表現(xiàn)為脾亢下脾臟內(nèi)CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯下降(正常脾IOD值2 370.48±1 127.28，脾亢下IOD值430.09±166.84)。

討 論

肝細(xì)胞肝癌仍是人類最致命、最常見的癌癥之一。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、酒精、糖尿病等不同病因?qū)е赂螕p傷，繼而發(fā)生炎癥、壞死和肝細(xì)胞增生。這種持續(xù)性的再生過程最終導(dǎo)致肝硬化，并最終發(fā)展為肝癌[4]。肝癌的免疫應(yīng)答是由腫瘤的抗原性和腫瘤組織的免疫微環(huán)境之間的平衡所決定的[5]。前者歸因于癌細(xì)胞中細(xì)胞信號突變和轉(zhuǎn)導(dǎo)的累積。另一方面肝臟本身處于一種獨特的免疫微環(huán)境，肝臟中免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞、以及與免疫有關(guān)的遺傳因素和環(huán)境因素也會影響對癌癥的免疫應(yīng)答[7]。因此，從癌組織、癌旁組織、脾臟及外周血等方面對肝癌的免疫內(nèi)環(huán)境進(jìn)行綜合分析，對肝癌預(yù)后評估及個體化免疫治療的發(fā)展具有重要意義。

我國肝硬化肝癌的患者往往同時伴有脾功能亢進(jìn)。正常情況下，脾臟作為人體最大的淋巴器官之一，含有抗原呈遞細(xì)胞(APCs)和B、T淋巴細(xì)胞，在脾臟血液循環(huán)中的抗原可被捕獲并呈遞給脾臟中的T淋巴細(xì)胞。脾臟的存在和完整性是免疫微環(huán)境的基礎(chǔ)。但在肝硬化門靜脈高壓，脾大脾功能亢進(jìn)時，患者機(jī)體處于一種以細(xì)胞免疫為主的免疫功能低下的全身反應(yīng)性病理狀態(tài)[8]。此時脾臟瘀血腫大，血流慢、缺氧，導(dǎo)致其免疫細(xì)胞的功能和形態(tài)的改變，使巨脾的輔助性T細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致免疫功能降低。

作為調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)的特征性標(biāo)志，F(xiàn)oxp3是控制Treg發(fā)育和功能所需要的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其水平可反映Treg的數(shù)量和功能狀態(tài)。Foxp3的缺失或過度表達(dá)均可使得Treg細(xì)胞的數(shù)量或功能發(fā)生異常，影響患者免疫功能。在本研究的實驗中，筆者觀察到在肝癌和癌旁的肝組織內(nèi)的Foxp3表達(dá)的T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)出彌散分布狀況，而在匯管區(qū)的Foxp3表達(dá)的T淋巴細(xì)胞，鏡下可觀察到明顯的集中分布趨勢。門靜脈高壓癥脾功能亢進(jìn)患者脾臟組織中的FOXP3表達(dá)量比對照組正常脾臟的表達(dá)明顯提高；Granzyme B在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)數(shù)量高于肝硬化和正常肝組織。這說明在腫瘤及癌旁組織中，活化的CTL和NK細(xì)胞數(shù)量明顯增多，局部細(xì)胞免疫狀態(tài)良好，這與腫瘤抗原的刺激有關(guān)。癌旁組織中 Granzyme B細(xì)胞數(shù)量高于癌組織可能是因為癌組織中伴有一些壞死組織，從而影響了Granzyme B的表達(dá)[9]；TGF-β1可促進(jìn)腫瘤血管的形成，使腫瘤生長加速，也能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成并抑制其降解，增加某些蛋白酶的活性，使基質(zhì)蛋白降解速度加快，提高活性，降低黏著性，增加腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移能力[10]。實驗可見TGF-β1蛋白在肝癌組織中存在要少于癌旁正常肝組織及正常肝臟組織。另外，許多研究都探討了腫瘤、Treg與TGF-β1的關(guān)系，表明TGF-β1在肝癌組織中的表達(dá)與Treg呈正相關(guān)。高Treg細(xì)胞浸潤的HCC組織5年生存率明顯低于Treg細(xì)胞浸潤的HCC組織[11]。

輔助性T淋巴細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物是CD4，在免疫反應(yīng)中扮演中間過程的角色，調(diào)控T淋巴細(xì)胞或輔助其他淋巴細(xì)胞發(fā)揮功能。CD4+T淋巴細(xì)胞主要是輔助性T淋巴細(xì)胞，通過釋放細(xì)胞因子參與抗腫瘤免疫效應(yīng)[12]；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物是CD8，針對HBV抗原的CD8+特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過分泌抗病毒細(xì)胞因子，在清除病毒中起重要作用，被認(rèn)為是病毒性肝炎發(fā)病免疫學(xué)的主要效應(yīng)細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可對靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 ，同時對CD4+T細(xì)胞有調(diào)節(jié)性抑制作用[13]。CD4/CD8比值可反映機(jī)體細(xì)胞的免疫功能，為衡量細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的標(biāo)志之一。正常人群中，CD4+/CD8+是動態(tài)平衡的狀態(tài)，反映機(jī)體處于免疫平衡[14]。在筆者實驗中觀察的結(jié)果，同既往實驗一致，當(dāng)發(fā)生惡性腫瘤如HCC時，患者體內(nèi)無論外周血，還是肝、脾的CD4+T 細(xì)胞水平下降而CD8+T 細(xì)胞上升，CD4+/CD8+比例失衡，逃避了機(jī)體免疫監(jiān)視，促進(jìn)了腫瘤發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)既往研究，在肝癌的各個階段，無論單藥還是聯(lián)合治療，免疫治療藥物均具有合理性及潛在優(yōu)勢，并且越來越多的證據(jù)支持在腫瘤的發(fā)展過程中應(yīng)盡早使用免疫治療。因為免疫藥物起效需要建立在相對健康的免疫系統(tǒng)上。肝癌患者免疫功能失調(diào)，且對于同時存在肝硬化脾功能亢進(jìn)的患者，這種免疫失調(diào)尤為明顯。因此在肝癌患者術(shù)后，免疫功能恢復(fù)時盡早開始相關(guān)的免疫治療，可能對肝癌患者的預(yù)后會起到關(guān)鍵作用。這將是解決肝癌術(shù)后低生存率研究工作的重要方向。