潘樂(lè)玉 郭德良 張玉仙 楊衛(wèi)華 王志剛

根治性肝切除術(shù)是肝癌的首選治療方式，但由于受術(shù)后殘肝體積的限制，僅約30%的病人適合手術(shù)治療[1]。有學(xué)者先后提出以下策略：(1)門(mén)靜脈結(jié)扎(portal vein ligation，PVL)前行肝動(dòng)脈介入栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)后2～4周再行肝腫瘤切除，臨床研究提示此策略能促進(jìn)保留側(cè)肝臟再生，抑制腫瘤生長(zhǎng)。但病人需經(jīng)歷2次有創(chuàng)操作，且二期手術(shù)前治療周期較長(zhǎng)(約8～16周)。(2)聯(lián)合肝臟離斷和門(mén)靜脈結(jié)扎二步肝切除(associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS)，ALPPS是一種全新的手術(shù)方式，為那些因?yàn)橛喔误w積不足無(wú)法行根治性手術(shù)切除的病人帶來(lái)了福音，但 ALPPS 的復(fù)雜性及術(shù)后高并發(fā)癥發(fā)生率(36.0%～64.0%)及死亡率(9.0%～28.7%)使其開(kāi)展及應(yīng)用受限[2-3]。接受ALPPS的病人需經(jīng)受2次手術(shù)打擊，對(duì)病人心理和生理均是巨大考驗(yàn)。我們以裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，結(jié)扎患側(cè)肝動(dòng)脈(hepatic artery ligation,HAL)并部分阻斷患側(cè)門(mén)靜脈血流(partial portal vein ligation,pPVL)，觀(guān)察保留側(cè)肝臟增生及腫瘤生長(zhǎng)情況。

材料與方法

一、材料

2018年9月～2018年12月，取健康4周齡裸鼠，體質(zhì)量(22.3±1.8)g SPF級(jí)，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。手術(shù)器械購(gòu)自上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司，麻醉藥物戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒和石蠟切片膠原纖維(Masson)染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

二、方法

圖中實(shí)體黑線(xiàn)代表部分阻斷門(mén)靜脈用的針頭，空芯箭頭表示門(mén)靜脈部分阻斷的部位。對(duì)門(mén)靜脈及動(dòng)脈做相應(yīng)處理后，肝右中葉、左內(nèi)葉及左外葉的沒(méi)有肝動(dòng)脈供血，門(mén)靜脈供血將減少

1.建立裸鼠肝細(xì)胞肝癌模型 ：方法如下：(1)選取1只裸鼠，麻醉后酒精消毒腋下皮膚，用1 ml注射器將濃度為107/ml鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6懸液0.1 ml注射至裸鼠腋下皮下組織內(nèi)，4周后成瘤大小約1.5 cm×1.5 cm，麻醉處死裸鼠后，完整取出腫瘤，用剪刀將腫瘤剪成大小約1 mm×1 mm瘤塊，置于生理鹽水中備用。(2) 裸鼠麻醉后，正中切口開(kāi)腹，以18G套管穿刺針，用顯微鑷將一小瘤塊經(jīng)套管針針尖處送至管腔內(nèi)。(3) 穿刺肝左外葉至被膜下肝實(shí)質(zhì)深約3～5 mm，置入針芯并緩慢推送瘤塊至肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，拔出穿刺針未見(jiàn)腫瘤塊脫出，證實(shí)穿刺成功，關(guān)腹。約2周后肝左外葉接種處成瘤，大小約0.7 cm×0.5 cm。

2.實(shí)驗(yàn)分組：建模成功后的肝細(xì)胞肝癌裸鼠120只隨機(jī)分4組：空白對(duì)照組(Sham,A組)、肝動(dòng)脈結(jié)扎組(HAL，B組)、部分門(mén)靜脈限流組(pPVL，C組)、肝動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合部分門(mén)靜脈限流組(HAL+pPVL，D組)，每組各30只。(1)A組：開(kāi)腹后僅對(duì)擬處理側(cè)門(mén)靜脈及肝動(dòng)脈進(jìn)行游離后關(guān)腹。(2)C組:開(kāi)腹后，自肝右上葉、右下葉與尾葉上方游離供應(yīng)肝中葉、左內(nèi)葉及左外葉的門(mén)脈及肝動(dòng)脈主干，對(duì)門(mén)靜脈及動(dòng)脈做相應(yīng)處理后，肝右中葉、左內(nèi)葉及左外葉的沒(méi)有肝動(dòng)脈供血，門(mén)靜脈供血將減少，處理肝葉約占總肝重的 78%(圖1)。用實(shí)時(shí)超聲波測(cè)量此時(shí)供應(yīng)肝中、左內(nèi)葉及左外葉的門(mén)脈及肝動(dòng)脈主干血流(ml/min)作為基線(xiàn)值。采用Yokoyama等[4]的方法實(shí)施pPVL，應(yīng)用0.25 mm針頭與門(mén)靜脈并行捆綁7-0絲線(xiàn)確切結(jié)扎(裸鼠的門(mén)靜脈直徑約1.0～1.5 mm)，將針頭抽出以實(shí)現(xiàn)部分阻斷門(mén)靜脈血流。操作過(guò)程中結(jié)合術(shù)中超聲(GE Logic E9，美國(guó))檢測(cè)血流量，以更準(zhǔn)確地控制阻斷程度及確保門(mén)靜脈通暢。限流成功5分鐘后，超聲波檢測(cè)預(yù)處理側(cè)肝動(dòng)脈血流變化，關(guān)腹。

3.標(biāo)本留?。盒g(shù)后24小時(shí)、72小時(shí)、1周、2周、3周留取標(biāo)本，A組及各實(shí)驗(yàn)組每時(shí)間點(diǎn)6只，處死C組及D組裸鼠前采用彩超了解小鼠結(jié)扎側(cè)門(mén)靜脈通暢情況。麻醉成功后，5 ml注射器于下腔靜脈留取血標(biāo)本后處死裸鼠，剪取保留側(cè)肝組織，分別稱(chēng)重保留側(cè)肝臟組織，測(cè)量腫瘤最大徑(a)、最小徑(b)。10%福爾馬林溶液固定后常規(guī)制作蠟塊。血液標(biāo)本離心后(3 000轉(zhuǎn)/分鐘、10分鐘)留取上清液血漿。

4.標(biāo)本檢測(cè)：組織切片后常規(guī)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各組各肝葉組織病理學(xué)改變。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB) 總膽紅素(TBIL)濃度，組間對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

5.裸鼠保留側(cè)肝臟重量測(cè)定及再生率計(jì)算：各組裸鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)未接扎肝再生率(HRR)=(WA-WI)/WI×100%。其中WA和W1分別代表裸鼠處死時(shí)測(cè)定的保留側(cè)肝實(shí)際重量及假手術(shù)組對(duì)應(yīng)肝葉的平均重量。

6.肝臟腫瘤體積測(cè)定：測(cè)量肝臟移植瘤最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b),計(jì)算腫瘤體積V=ab2/2[5]。

7.微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)標(biāo)本取材方案：參照七點(diǎn)基線(xiàn)取材方案,分別在腫瘤標(biāo)本的12點(diǎn)(A點(diǎn))、3點(diǎn)(B點(diǎn))、6點(diǎn)(C點(diǎn))和9點(diǎn)(D點(diǎn))方位上癌旁肝組織交界處按取材，重點(diǎn)觀(guān)察腫瘤對(duì)包膜、血管以及鄰近肝組織的侵犯方式和累及范圍；在顯微鏡下于內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管腔內(nèi)見(jiàn)到癌細(xì)胞巢團(tuán)，判定 MVI陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

D組1只裸鼠因門(mén)靜脈血栓急性形成，術(shù)后72小時(shí)內(nèi)死亡，C組1只裸鼠因腹腔出血，在術(shù)后24小時(shí)內(nèi)死亡。

1.血清生化指標(biāo)檢測(cè)：ALT及AST濃度水平在術(shù)后24小時(shí)及72小時(shí)，C組及D組與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在術(shù)后1周，2周，3周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組比A組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組及D組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組間ALB比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1、表2)。TBIL在D組術(shù)后24小時(shí)比A組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在術(shù)后72小時(shí)、1周、2周及3周，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組與A組在各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、表2)。

表1 不同手術(shù)方式在術(shù)后不同時(shí)間段各臨床指標(biāo)

2.保留側(cè)肝臟增生率測(cè)定 :C組及D組保留側(cè)肝臟質(zhì)量(尾狀葉，右上葉及右下葉)增加與A組及B組在術(shù)后72小時(shí)，1周，2周，3周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組與D組保留側(cè)肝臟質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B組與A組保留側(cè)肝臟質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1、表2)。

3.各組裸鼠肝臟腫瘤大小測(cè)定：HAL組及D組腫瘤大小與C組及A組在術(shù)后1周，2周及3周比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組與D組腫瘤大小無(wú)差異，C組與A組腫瘤大小無(wú)差異(表1、表2)。

表2 各臨床指標(biāo)在術(shù)后不同時(shí)間段不同手術(shù)方式的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

4.MVI測(cè)定：將A組與C組合并為參照組共12例，B組與D組合并為實(shí)驗(yàn)組共12例。參照組在術(shù)后24小時(shí)、72小時(shí)、1周、2周及3周 MVI陽(yáng)性率小鼠個(gè)數(shù)分別為0、0、0、3及0只。實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后24小時(shí)、72小時(shí)、1周、2周及3周 MVI陽(yáng)性率小鼠個(gè)數(shù)分別為0、1、1、1及6只。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后2周及3周MVI陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且術(shù)后累積MVI例數(shù)與未MVI例數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討論

手術(shù)切除腫瘤是肝臟原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤根治性治療的主要方式，但對(duì)于剩余肝臟體積過(guò)小，無(wú)法耐受大范圍肝切除術(shù)的病人，只能接受姑息性非手術(shù)治療，療效往往不盡如人意[6]。

pPVL可促進(jìn)保留側(cè)肝臟的代償性增生，增加手術(shù)后保留側(cè)肝臟體積，使部分病人重新獲得手術(shù)治療的機(jī)會(huì)[7]。但術(shù)前pPVL在誘導(dǎo)保留側(cè)肝再生的同時(shí)會(huì)促進(jìn)患側(cè)腫瘤生長(zhǎng)[8]。對(duì)肝癌大鼠部分門(mén)靜脈結(jié)扎后發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)保留側(cè)肝再生的同時(shí)會(huì)促進(jìn)患側(cè)腫瘤生長(zhǎng)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中也看到，盡管C組腫瘤增大與A組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與B組及D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，僅行PVL或pPVL在等待殘肝代償增生的階段，腫瘤可能進(jìn)展至保留側(cè)肝葉內(nèi)(尤其是腫瘤位置靠近保留側(cè)的肝葉時(shí))或侵犯至肝內(nèi)較大血管分支，甚至轉(zhuǎn)移至肝外，使預(yù)期的二期肝切除術(shù)無(wú)法實(shí)施。

pPVL促使患側(cè)腫瘤生長(zhǎng)可能與肝臟血流動(dòng)力學(xué)的改變相關(guān)[11]。pPVL患側(cè)肝葉肝動(dòng)脈血流反射性增加(肝動(dòng)脈Buffer效應(yīng))，促使以肝動(dòng)脈供血為主的肝癌進(jìn)展。在本實(shí)驗(yàn)中，B組及D組腫瘤大小與C組及A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明結(jié)扎肝臟動(dòng)脈后，肝臟腫瘤血供減少，生長(zhǎng)減慢。

HAL的主要抗癌機(jī)制是腫瘤“去血供”導(dǎo)致缺氧,殺傷多數(shù)腫瘤細(xì)胞,抑制其生長(zhǎng),但缺氧作為一種篩選手段,賦予耐受缺氧的腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移潛能[12-14]。為探討肝動(dòng)脈結(jié)扎對(duì)腫瘤侵襲性的影響，因?qū)嶒?yàn)裸鼠數(shù)量有限，我們將A組與C組合并為對(duì)照組，B組與D組合并為實(shí)驗(yàn)組，兩組術(shù)后3周MVI陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明肝動(dòng)脈結(jié)扎可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞肝內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3周與術(shù)后2周 MVI陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，D等待肝臟增生時(shí)間應(yīng)在兩周以?xún)?nèi)為佳，過(guò)長(zhǎng)的等待時(shí)間預(yù)示預(yù)后不良。

該實(shí)驗(yàn)建立裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停M管ALT及AST在C組及D組術(shù)后24小時(shí)及72小時(shí)比A組明顯升高，但在術(shù)后1周明顯下降，且與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HAL+pPVL對(duì)肝臟細(xì)胞的損傷是可逆的。

D組1只裸鼠因門(mén)靜脈血栓急性形成在術(shù)后72小時(shí)內(nèi)死亡。因裸鼠的結(jié)扎側(cè)肝動(dòng)脈結(jié)扎，門(mén)靜脈急性血栓形成可導(dǎo)致肝臟組織壞死感染，導(dǎo)致嚴(yán)重后果，提示圍手術(shù)期抗凝是必要的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HAL+pPVL可以促進(jìn)保留側(cè)肝臟代償增生，同時(shí)在一定時(shí)間內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，為部分晚期肝癌病人診斷提供了新的治療思路。但裸鼠缺少免疫系統(tǒng)且沒(méi)有肝纖維化背景，因此其部分結(jié)論推廣至人類(lèi)，尚需進(jìn)一步的深入研究。