史冬泉 李嘉威

軟骨是人體中必不可少的組織，分布在人體的四肢關節(jié)，椎間盤，支氣管和外耳輪廓等。四肢關節(jié)處的軟骨組織為透明軟骨，主要起著承重和抗磨損的作用。膝關節(jié)、髖關節(jié)等承重關節(jié)的透明軟骨在骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)中產生磨損和退變是其主要致病因素之一。軟骨組織中因為缺乏血管，神經(jīng)和淋巴組織，其自身修復能力十分有限。一項針對OA軟骨細胞的單細胞轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，在OA進展的晚期階段，關節(jié)中的透明軟骨在經(jīng)歷炎癥和磨損后逐漸被纖維軟骨所取代[1]。傳統(tǒng)的軟骨修復技術，包括自體軟骨細胞植入和微骨折無法復制出天然軟骨組織的生物力學特性[2]。有研究報道在自體軟骨細胞植入后，關節(jié)中的生物力學環(huán)境和化學環(huán)境會導致軟骨細胞呈成纖維細胞表型，導致90%以上的新生修復組織為纖維軟骨[3]。正常的軟骨能夠承受的力高達體重的6倍[4]。承重時，透明軟骨的細胞外基質內部的靜電和空間相互作用阻止了水分流失并承擔了大部分負載。但是，纖維軟骨無法實現(xiàn)這種結構-功能關系[5]。所以纖維軟骨在承重和抗機械磨損方面的能力遠不如透明軟骨，關節(jié)中纖維軟骨會導致OA病情的進一步惡化[6]。近年來發(fā)展迅速的軟骨組織工程雖然為透明軟骨的生成提供了很多的選擇[7]，但纖維軟骨始終被作為摒棄的對象，沒有加以利用和開發(fā)。因此，OA和軟骨損傷后所產生的纖維軟骨是不可忽視的存在且必須考慮軟骨損傷修復治療原則中。阻止透明軟骨纖維化和促進纖維軟骨透明化有效利用原位纖維軟骨改性，將作為研究開發(fā)的重點。本文將從纖維軟骨產生的病理機制出發(fā)，討論透明軟骨和纖維軟骨的差別，并進一步探索針對纖維軟骨的治療策略，提出"纖維軟骨透明化"的治療原則，展望纖維軟骨透明化的可行性。纖維軟骨透明化的關鍵是利用病變或周圍區(qū)域的細胞外基質(包括膠原蛋白和糖蛋白)，以及動員或修飾鄰近的組織和細胞(纖維軟骨細胞和透明軟骨細胞)以實現(xiàn)轉化。

一、關節(jié)軟骨纖維化是纖維軟骨產生的主要原因

組織損傷的修復過程包括細胞增殖，細胞分化以及細胞外基質的合成和重塑。但是異常的修復過程會導致組織中細胞外基質蛋白的過度分泌和沉積，繼而引起過度的纖維化，最終導致瘢痕形成甚至組織破壞[8]。雖然在其他類型的軟骨組織(如半月板或椎間盤)中可以發(fā)現(xiàn)纖維軟骨的存在，但在關節(jié)軟骨中它的出現(xiàn)卻提示著軟骨組織的退變損傷。OA過程或軟骨損傷修復中形成的纖維軟骨就是關節(jié)軟骨過度纖維化的結果。在病理條件下，軟骨細胞的合成分解代謝的紊亂會導致軟骨損傷和退變。因此原本處于靜止狀態(tài)的透明軟骨細胞開始活躍增生，并在軟骨病變區(qū)域中形成細胞簇，以適應軟骨微環(huán)境的變化[9]?；钴S增殖的軟骨細胞開始轉變或去分化為具備成纖維細胞表型的細胞。其細胞形狀，代謝方式和細胞骨架結構發(fā)生急劇變化，最終導致Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ)合成的增加，該膠原蛋白通過形成無機械能力的纖維軟骨樣組織而削弱了軟骨組織的生物功能[10]。在正常的關節(jié)透明軟骨中，Ⅰ型膠原蛋白僅占總體積的1.7%，而Ⅱ型膠原蛋白占近100%。Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ)表達的減少和Ⅰ型膠原蛋白表達的增加是關節(jié)軟骨細胞去分化和纖維化的主要特征。軟骨細胞和周圍環(huán)境的這些變化最終導致異常的軟骨細胞增殖和肥大分化，最終引起軟骨細胞凋亡。

二、透明軟骨與纖維軟骨

透明軟骨是最常見的軟骨類型，在發(fā)育過程中可作為胚胎的臨時骨架直到逐漸被骨組織替代為止。透明軟骨的基質由豐富的糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)和高度黏附的膠原纖維組成[11]，其軟骨細胞的形態(tài)主要為圓形。透明軟骨的主要膠原蛋白類型是Ⅱ型膠原蛋白(> 90%)，但是Ⅲ型膠原蛋白(0～10%)，Ⅸ型膠原蛋白(1%)，Ⅺ型膠原蛋白(3%)，Ⅵ型膠原蛋白在調節(jié)軟骨細胞機械轉導中起著重要作用。Ⅱ型膠原蛋白是透明軟骨細胞外基質的主要固體成分，可通過限制帶負電荷的GAGs施加的溶脹壓力來提供組織的整體形狀。在OA或軟骨損傷過程中，形成的最常見的非透明軟骨組織是機械性較差、富含Ⅰ/ Ⅱ型膠原蛋白的纖維軟骨。但是目前對于纖維軟骨仍然缺乏一個精準的定義，因此纖維軟骨組織學和免疫組織化學特征成為鑒定的基礎。有研究報道，纖維軟骨是一種介于透明軟骨與密集規(guī)則的結締組織(如肌腱和韌帶)之間的過渡組織[12]。Ⅰ型膠原蛋白的增加使得軟骨的細胞外基質的排列變得更加致密，軟骨細胞呈現(xiàn)如成纖維細胞樣的梭形狀態(tài)，因此無法實現(xiàn)透明軟骨原有的承重和抗磨損的生物功能。相對于透明軟骨細胞，纖維軟骨細胞最重要的特征就是產生成纖維細胞的表型，比如包含α-SMA(α-smooth muscle actin),一種纖維細胞所含有的細胞骨架蛋白。因此纖維軟骨細胞表型的特征可以概括為以下幾點:(1)同時表達軟骨細胞表型蛋白(SOX9,Col Ⅱ)和纖維細胞表型蛋白(α-SMA,Col Ⅰ);(2) Ⅱ型膠原和Ⅰ型膠原的蛋白表達或者mRNA表達水平的比例約為0.2～1[12];(3) 間充質干細胞(mesenchymal stromal stem cells,MSCs)和造血干細胞的表面標志物(CD106,CD146,ITGA11,CD34,CD45,CD133) 處于低表達水平[1]。

纖維軟骨的形成以及透明軟骨細胞的纖維化涉及到許多復雜的生物過程和信號通路。其中最為關鍵的兩個細胞因子是轉化組織生長因子-β(transform growth factor-β，TGFβ)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)。TGFβ-SMAD2/3信號通路在透明軟骨形成的生物過程中扮演重要角色，能夠促進SOX9轉錄因子和Ⅱ型膠原蛋白的表達，加強成軟骨分化和維持軟骨表型。但是CTGF的表達同樣也受TGFβ表達介導，其能夠促進Ⅰ型膠原表達并在組織纖維化的過程中起關鍵作用。同時過度表達的TGFβ將會激活SMAD1/5/8通路以加強軟骨肥大化過程。因此，功能紊亂的TGFβ信號通路和CTGF誘導的纖維化作用是軟骨細胞表型發(fā)生改變的關鍵因素。同樣，軟骨細胞外基質中的幾種成分也會影響軟骨細胞的表型和行為，例如富含亮氨酸的小蛋白聚糖(small leucin-rich proteoglycans,SLRPs)[13]，腱生蛋白C(tenascin-C)[14]，層黏連蛋白(Laminin)和軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)[15]。此外，細胞外基質或關節(jié)軟骨的微環(huán)境也會影響損傷或退變期間的軟骨細胞，包括炎癥因子水平，基質降解酶的活性和組織中的氧含量。對于軟骨細胞纖維化過程的認識以及透明軟骨和纖維軟骨區(qū)別的理解是開展纖維軟骨透明化策略最重要的基礎。

三、纖維軟骨透明化的展望

近年來對于軟骨組織和細胞的生理病理學的深入理解推動了軟骨損傷修復中透明軟骨形成的研究。然而，纖維軟骨是在OA和軟骨損傷中不可避免形成的副產物?？紤]到纖維軟骨是導致關節(jié)功能進一步惡化的主要因素之一，因此本文認為將纖維軟骨原位改造或修飾為透明軟骨，即“纖維軟骨透明化”作為軟骨損傷修復治療的重要原則之一是十分必要的。損傷或病變區(qū)域軟骨的細胞外環(huán)境的改性或修飾以及纖維軟骨細胞自身轉化，是纖維軟骨原位改造的兩個重要出發(fā)點。此外，加強透明軟骨表型和抑制纖維化作用是擬開展纖維軟骨透明化的兩個重要方向。

四、原位纖維軟骨細胞改性促進纖維軟骨透明化

軟骨組織是人體重要的承重組織，因此軟骨細胞內的細胞骨架在感知細胞外基質的機械信號以及轉為生物信號的過程中扮演重要角色。細胞骨架網(wǎng)絡是一種高度組織化的結構，可調節(jié)許多不同的細胞生物過程，包括改變細胞形狀，細胞器運動，細胞遷移，內吞作用，分泌，細胞分裂和細胞外基質形成。有研究報道，細胞骨架的分布和排列以及細胞的基本結構可以通過調節(jié)細胞黏附性來影響軟骨細胞的代謝和分化[16]。細胞松弛素D(cytochalasin D) 能夠通過抑制軟骨細胞微絲蛋白(actin)的聚合來促進軟骨相關蛋白的表達來維持軟骨功能[17]。此外，維持中間絲蛋白(vimentin intermediate filament)網(wǎng)絡結構的完整性有利于軟骨表型的維持，其結構的紊亂或破壞會導致關節(jié)軟骨的退變，OA病情的進展以及關節(jié)功能的惡化[18]。細胞骨架重塑會影響軟骨細胞蛋白質的合成和分泌，進而決定細胞的行為和功能，再而確定軟骨細胞分化的方向。盡管細胞骨架重塑具有一定成軟骨作用，但是是否可以從細胞自身內部轉化的角度將退變的纖維軟骨細胞恢復為透明軟骨細胞仍需進一步研究。

各類生長因子，包括CTGF、TGFβ和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors,FGFs)和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)在由于其強大的增殖潛力以及在合成分解代謝上的影響能力，在軟骨修復中得到廣泛研究。CTGF是CCN家族的重要成員。有研究報道，使用CTGF和TGFβ同時誘導間充質干細胞可使其分化為α-SMA陽性的纖維細胞以用于結締組織的修復[19]。在FGF家族中，F(xiàn)GF18與軟骨細胞的FGFR3特異性相互作用，參與軟骨生成和骨骼發(fā)育，改善健康軟骨細胞的增殖和細胞外基質的產生[20]。IGF-1是軟骨的主要合成代謝因子，并且在軟骨穩(wěn)態(tài)維持，平衡蛋白聚糖合成和軟骨細胞分解中起關鍵作用[21]。因此，在纖維軟骨細胞中通過生物學手段調控各類生長因子的水平和活性來進行纖維軟骨透明化具有一定可行性。

五、原位纖維軟骨細胞外環(huán)境修飾促進纖維軟骨透明化

細胞外環(huán)境的組成環(huán)境包括細胞外基質，細胞外氧含量，細胞外離子水平(滲透壓)以及炎癥因子和基質降解酶等。這些因素都能夠成為促進纖維軟骨透明化策略的研究對象。膠原蛋白是軟骨細胞外基質最主要的成分，并在維持軟骨組織的結構和形態(tài)以及生物功能中起重要作用。Ⅱ型膠原蛋白的含量決定了透明軟骨的質量和組織的功能。據(jù)報道，除了構成組織的結構外，額外的Ⅱ型膠原蛋白補充還可以通過增加GAG和Ⅱ型膠原蛋白的表達而加強軟骨細胞的成軟骨能力[22]。外源補充Ⅱ型膠原蛋白具有兩個優(yōu)勢，即通過填充原始的細胞外基質來改善局部軟骨組織的Ⅱ/Ⅰ型膠原的比例以及增強原位纖維化組織中細胞的成軟骨能力。另外，在OA發(fā)展或軟骨損傷期間，軟骨下骨內的細胞血管生成因子表達升高，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血小板來源的生長因子B(platelet-derived growth factor subunit B，PDGFB)，以增加軟骨下骨內的血管密度。此外，病理原因導致的新生血管形成導致軟骨內氧含量水平上調，從而破壞了軟骨區(qū)域內原本低氧性環(huán)境。有研究驗證缺氧作用能夠增強Ⅱ型膠原和蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)的表達并降低I型和X型膠原的水平[23]。缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors,HIF)是一類重要的轉錄激活因子，可調節(jié)細胞對缺氧的病理生理反應。由于軟骨細胞在生理條件下適應低氧環(huán)境，因此軟骨細胞中HIF-1α的表達活躍可能是對軟骨缺氧低氧環(huán)境中生存的主要適應方法。此外，HIF-1α在早期骨骼生成過程中缺氧環(huán)境中能夠顯著促進軟骨前細胞中SOX9的表達和軟骨形成[24]。因此，缺氧或HIF-1α在纖維軟骨細胞中的作用以及針對纖維軟骨透明化的可行性有待進一步研究。軟骨細胞外基質的滲透壓大約為350～450 mOsm，主要由局部的多糖濃度和離子水平?jīng)Q定。細胞外基質中GAG的側鏈富含負電荷，因此會吸引關節(jié)液中大量陽離子，包括Na+，K+,Ca2+等。軟骨細胞外基質特殊的離子環(huán)境為其提供了一個高滲環(huán)境。類風濕性關節(jié)炎或OA發(fā)生時，關節(jié)腔內的滑液的滲透壓會下降四分之一左右，從而進一步引起關節(jié)軟骨和關節(jié)內組織的細胞生物表型的改變。我們有理由相信，關節(jié)內滲透壓的調節(jié)將會是在纖維軟骨透明化策略中可行且有效的手段。

六、軟骨組織工程在纖維軟骨透明化中的作用

軟骨組織工程是運用于軟骨修復的一項結合生物學和工程學等多學科的策略。軟骨組織工程在OA治療以及軟骨修復的基礎實驗研究和動物實驗中取得巨大進展。可注射型水凝膠(hydrogel)不僅可以提供類似于透明軟骨細胞外基質的生物相容性以及高度水合的3D結構，并且還能夠通過其本身的黏彈性特性來改善營養(yǎng)物質和生長因子的輸出，甚至可以包載具有干性的細胞來更有效地進行細胞移植和傳遞生物活性分子[25]?？勺⑸湫退z為軟骨再生提供了有希望的方向，但是在考慮纖維軟骨透明化時，生物材料的設計要結合纖維軟骨原位改造的原則并且需要探索更多手段以保證更加有效地實施。

七、總結

纖維軟骨透明化是符合臨床實際情況和軟骨病理生理情況的軟骨修復策略。然而，纖維軟骨透明化的研究還面臨著一些挑戰(zhàn)。首先，很難獲得用于體外實驗的表型穩(wěn)定的纖維軟骨細胞。其次，將在組織上已經(jīng)形成的纖維軟骨逆轉為透明軟骨并恢復為原始的細胞外基質結構是相當困難的。第三，需要更加合理且智能的生物材料來輔助完成纖維軟骨透明化策略。為了避免對健康組織的影響，能夠智能且特異地靶向治療纖維軟骨的生物材料是必不可少的。此外，藥物和生物活性因子如何向致密纖維基質里滲透也是研究方向之一。纖維軟骨透明化是一個新的概念和研究方向，目前還沒有證據(jù)明確的研究結果以及邏輯清晰的研究方案，所以這需要眾多軟骨修復研究者共同努力去解決這一令人困擾的問題。我們相信纖維軟骨透明化是軟骨修復的最有希望和潛力的治療原則和策略。