羅志威，林元山

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

煙草黑脛病（Tobacco black shank）又稱煙草疫病，致病菌為煙草疫霉菌，俗稱爛腰、黑根，多發(fā)于成株期，少數(shù)發(fā)生在苗床期，其發(fā)病率達到5%～20%，嚴重的達50%以上，我國平均每年因煙草黑脛病造成的經(jīng)濟損失達1億元以上，僅次于煙草病毒病[1]。煙草疫霉菌的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治（輪作、抗病品種選育[2]）、化學(xué)防治[3]（代森錳鋅、惡霜靈、肉桂酰胺類殺菌劑氟嗎啉、金雷多米爾錳鋅）和生物防治[4-5]。農(nóng)業(yè)防治法和化學(xué)防治法容易出現(xiàn)農(nóng)藥殘留、產(chǎn)生抗藥性，單一種植導(dǎo)致抗病品種退化、生態(tài)環(huán)境失衡等問題[6]。生物防治法具有安全有效、綠色環(huán)保的特點，應(yīng)用前景廣闊[7]。為此，筆者進行了煙草疫霉菌拮抗菌的篩選，以期從湖南省煙草種植區(qū)土壤中篩選具有煙草疫霉菌拮抗作用的功能菌，為煙草病害的生物防治提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 煙草疫霉菌 供試煙草疫霉菌由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草生物科學(xué)與工程技術(shù)中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，瓊脂粉20 g（僅固體培養(yǎng)基），蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。（2）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，切碎煮沸30 min，200目篩過濾后定容到1 000 mL，然后加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉。（3）燕麥培養(yǎng)基：燕麥30 g，煮沸1 h后，紗布過濾定容到1 000 mL，然后加入20 g瓊脂粉。（4）10% V8汁培養(yǎng)基：美國V8蔬菜汁100 mL與1 g碳酸鈣混合均勻，3 000 r/min 離心后取上清液，加自來水定容到1 000 mL，pH自然值。（5）阿須貝無氮培養(yǎng)基：甘露醇10 g，CaCO35 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，NaCl 0.2 g，瓊脂粉20 g，加自來水定容到1 000 mL。（6）解無機磷培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g，葡萄糖 2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.2 g，CaCO32.5 g，Ca3(PO4)210 g，MnSO40.02 g，F(xiàn)eSO40.02 g，瓊脂粉20 g，pH值7.2，加自來水定容到1 000 mL。以上培養(yǎng)基均在121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤細菌的分離 從湖南省瀏陽市北盛、淳口、洞陽等地采集煙草疫霉病發(fā)病嚴重?zé)熖锏慕】抵仓旮?～10 cm處的土壤約400 g，分裝標記帶回。稱取處理后的土樣10 g，放入裝有玻璃珠和100 mL無菌水的三角瓶中，160 r/min震蕩30 min。將混合均勻的液體，逐級以10倍稀釋，分別吸取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液100 μL加到LB固體培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至30℃的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)3 d。

1.2.2 拮抗細菌的篩選 將活化的煙草疫霉菌接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用直徑6 mm打孔器打取生長良好菌餅，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基的平板中央。采用平板對峙法將純化后的細菌點接或劃線在煙草疫霉菌餅對稱位置，28℃下培養(yǎng)5 d左右，待對照皿中煙草疫霉病絲鋪滿培養(yǎng)皿時，測量菌落直徑，按公式（1）計算抑制率。

1.2.3 拮抗細菌LZW-118的鑒定 將篩選獲得的LZW-118菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落外觀和形態(tài)，挑取菌落進行革蘭氏染色，生理生化測定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行。菌株16S rDNA 測序由華大基因公司完成，測序結(jié)果通過NCBI GenBank進行Blast序列同源性比對，使用MAGE 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 促生潛力初探 （1）解鉀能力鑒定。將菌株接種至解鉀培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察是否有解鉀圈。（2）解磷能力鑒定。將菌株接種至解磷培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察是否有溶磷圈。（3）固氮能力鑒定。將菌株接種至阿須貝無氮培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌株是否能生長。（4）盆栽試驗。以K326為供試煙草品種。供試發(fā)酵液制備：將LZW-118菌株接種到LB培養(yǎng)基中，30℃下160 r/min培養(yǎng)96 h待用，調(diào)整發(fā)酵液濃度至2×108CFU/mL。供試煙草培育：采用漂浮育苗法培育煙草幼苗，30 d后將幼苗移在到盆栽中，栽培基質(zhì)為草炭和珍珠巖按照重量比7∶3配制而成。盆栽試驗處理：設(shè)3個處理，分別為清水對照處理（CK）、LB培養(yǎng)基處理（T1）、LZW-118發(fā)酵液處理（T2）。在煙草定植到盆栽3 d后進行初次灌根處理，每株20 mL（5 mL發(fā)酵液或LB培養(yǎng)基+15 mL清水混勻），7 d后進行第2次灌根處理，水肥管理參照GB/T 23221—2008 烤煙栽培技術(shù)規(guī)程進行。在團棵期測量煙草農(nóng)藝性狀，測量方法參照YC/T 142—2010。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵液對煙草疫霉菌的影響 挑取1環(huán)培養(yǎng)好的LZW-118菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)96 h，10 000 r/min離心10 min收集上清液，經(jīng)0.25 μm針孔濾膜過濾待用。采用管碟法[8]測定拮抗菌發(fā)酵液對煙草疫霉菌的影響。培養(yǎng)皿中放入牛津杯，將冷卻至55℃的燕麥培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約20 mL；培養(yǎng)基冷卻凝固后取出牛津杯，用移液槍取10 μL燕麥培養(yǎng)基注入牛津杯孔封底；吸取接種至V8汁培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的煙草疫霉菌發(fā)酵液 0.1 mL至培養(yǎng)皿，均勻涂開；加入過濾好的LZW-118菌株上清液50 μL，以無菌水為對照，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，按公式（2）計算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對煙草疫霉病的抑制效果

試驗結(jié)果顯示，從煙草植株根際土壤中共篩選出43株對煙草疫霉有拮抗作用的細菌，其中部分拮抗菌對煙草疫霉菌的抑制率62.16%～71.14%（表1），以LZW-118菌株的拮抗能力最強（圖1），抑制率達71.14%。

表1 部分拮抗菌對煙草疫霉病的抑制率

圖1 拮抗菌株對煙草疫霉病的抑制作用

2.2 菌株LZW-118的鑒定

2.2.1 菌株LZW-118形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征 在LB固體培養(yǎng)基上，菌株LZW-118菌落成圓形、乳黃白色，凸起、邊緣整齊，表面光滑濕潤（圖2C），革蘭氏染色為陰性，細菌形態(tài)呈直桿狀。結(jié)合拮抗菌株LZW-118生理生化特征（表2）和形態(tài)特征，初步判定LZW-118菌株屬于伯克氏菌屬。

表2 LZW-118菌生理生化特征

圖2 ZW-118菌株在不同培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)及溶磷作用

2.2.2 16S rDNA 序列分析與系統(tǒng)進化樹 將獲得的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中己知序列進行對比，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，菌株LZW-118 與Burkholderia vietnamiensisstrainLMG 10929的序列同源性達到99.79%，且菌株LZW-118生理生化特征與越南伯克霍爾德氏菌基本一致?；谏飳W(xué)特征及16S rDNA 序列分析，初步鑒定LZW-118為越南伯克霍爾德氏菌 （Burkholderia vietnamiensisstrainLZW-118）。

圖3 基于 16S rDNA 序列構(gòu)建的菌株LZW-118 系統(tǒng)發(fā)育

2.3 促生潛力初探

初步探索了LZW-118菌株的促生潛力，結(jié)果顯示，拮抗菌LZW-118在解無機磷平板中形成溶磷圈（圖2D），具有解無機磷功能；其在鉀長石培養(yǎng)基中能生長，但是沒有形成解鉀圈；其在阿須貝無氮培養(yǎng)基中可以生長（圖2E），可能具有固氮作用。由表3可知，施用拮抗菌LZW-118發(fā)酵液對煙草農(nóng)藝性狀有較好地促進效果；在株高方面，與CK相比較，T2處理煙草的株高、葉長、葉寬、莖圍、葉片數(shù)均有顯著提升，分別增加19.91%、15.49%、5.23%、3.09%、8.33%；T1與CK相比農(nóng)藝性狀略優(yōu)，但相差不大。這表明LZW-118菌株有較大的促生潛力。

表3 不同處理對煙草農(nóng)藝性狀的影響

2.4 拮抗菌發(fā)酵液對煙草疫霉菌的影響

由圖4可知，LZW-118菌株發(fā)酵液上清對煙草疫霉菌有較強的抑制作用，抑制率達到80.07%，表明發(fā)酵液中含有某種物質(zhì)可以抑制煙草疫霉菌的生長。

圖4 LZW-118菌株發(fā)酵液對煙草疫霉菌的拮抗作用

3 小結(jié)與討論

研究結(jié)果表明，從煙草根際篩選的LZW-118菌株為越南伯克霍爾德氏菌，對煙草疫霉的抑制作用顯著，同時兼具溶磷固氮功能，可顯著提高煙草株高、葉長、葉片數(shù)等農(nóng)藝性狀，具有較好的應(yīng)用前景。有研究表明，越南伯克霍爾德氏菌對多種土傳病菌具有較強的抑制能力，并且具有良好的促進植物生長功能。胡雪[9]篩選的越南伯克霍爾德氏菌PH2具有較好的溶磷作用，對水稻稻瘟病和紋枯病病原菌具有較好的抑制作用。李萍等[10]篩選的越南伯克霍爾德氏菌BTF5對西瓜枯萎病的抑制率達63.09%，經(jīng)過8代傳代培養(yǎng)后抑制效果依然穩(wěn)定。喬志偉等[11]從黃壤中分離出多株溶磷細菌，其中伯克氏菌屬菌株W4的溶磷能力為 564.07 mg/L，顯著高于其他菌株，具有良好的溶磷特性。陳凱等[12]通過溫室防病增產(chǎn)效果試驗發(fā)現(xiàn)越南伯克霍爾德氏工程菌株B418-37對黃瓜立枯病的防治效果達87.0%，菌株處理過的黃瓜幼苗生物量比空白對照增加19.7%；對小麥紋枯病的防治效果達 94.5%，生物量增加28.6%；這表明伯克氏菌株具有良好的生防效果。毛曉潔等[13]篩選出的伯克氏菌屬菌株固氮酶活性達到（32.286±2.076） nmol/(h·mg)，ACC脫氨酶活性達到（5.393±0.362）μmol/(h·mg)，與無氮處理相比，越南伯克氏菌處理的白菜鮮重提高了46.59%，顯示出了良好的促生潛能。目前，有關(guān)越南伯克霍爾德氏菌對煙草疫霉菌的防治作用尚未見報道，該研究獲得的煙草疫霉菌拮抗菌株可為今后的煙草黑脛病生物防治提供優(yōu)質(zhì)生防資源。