田露露

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海201700）

酸奶適合乳糖不耐受人士飲用[1-2]。普通酸奶是以生牛（羊）乳或乳粉為原料，通過保加利亞乳桿菌（德氏乳桿菌保加利亞亞種）和嗜熱鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)生的[1-3]。酸奶發(fā)酵過程中加入益生菌、益生元或者不同的植物提取物，可以產(chǎn)生營養(yǎng)、味感、物理化學(xué)和流變學(xué)特性不同的功能性酸奶。研究表明，番茄汁、維生素、糖、酪蛋白水解物、抗氧化劑、酶、礦物質(zhì)、氨基酸（如L-半胱氨酸）、谷物、蔬菜、水果、濃縮乳清蛋白和酵母抽提物可以通過提供嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌必需的營養(yǎng)因子和適當(dāng)?shù)臈l件（pH、氧化還原電位）來提高細(xì)菌生長速度[1,3-5]。表面活性劑對發(fā)酵的促進作用也有報道[6]，而單硬脂酸甘油酯（簡稱單甘酯）在酸奶發(fā)酵中一般是作為乳化劑和增白劑[7]。

酸奶發(fā)酵過程中，pH 和滴定酸度對益生菌的活力和代謝特征有較大的影響。在低pH 時（＜4.5），需要大量能量維持細(xì)胞內(nèi)pH，從而會導(dǎo)致ATP 的不足[1]。酸奶發(fā)酵的pH 對酸奶粘度和硬度等質(zhì)構(gòu)也有一定的影響[8]。因此，本文在酸奶發(fā)酵過程中添加酶、乳化劑、抗氧化劑、生長因子等物質(zhì)，監(jiān)測pH、酸度、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味等指標(biāo)，推測這些物質(zhì)能否促進酸奶發(fā)酵，以減少不良因素引起的發(fā)酵速度異常。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵劑及奶粉

不同比例的發(fā)酵劑型號（GF359、GF377、GF686、GF931）由不同比例和菌株的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌混合而成，其中第一個阿拉伯?dāng)?shù)字代表產(chǎn)品的粘度，數(shù)字越大，粘度越大；第二個阿拉伯?dāng)?shù)字代表產(chǎn)品的產(chǎn)酸速度（產(chǎn)品發(fā)酵終點pH 4.5 左右時間為依據(jù)），數(shù)字越大，產(chǎn)酸速度越快；第三位數(shù)字代表產(chǎn)品后酸化情況（產(chǎn)品發(fā)酵結(jié)束冷藏12 h 后酸度增加值為依據(jù)），數(shù)字越大，后酸化越弱。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌由潤盈生物工程（上海）有限公司提供。全脂奶粉，新西蘭恒天然集團。

1.1.2 酶、乳化劑及生長因子

胰蛋白酶（Trypsin，簡稱胰酶），sigma-aldrich；木瓜蛋白酶（Papain，簡稱木瓜酶），sigma-aldrich，≥10 units/mg protein；菠蘿蛋白酶（bromelain，簡稱菠蘿酶），sigma-aldrich，≥3 units/mg protein；β-D 半乳糖苷酶（β-galactosidase)，sigma-aldrich，≥0.15 units/mg protein；酪蛋白水解物（Casein acid hydrolysate），sigma-aldrich；番茄粉（tomato powder），道勤生物科技（上海）有限公司；L-半胱氨酸（L-cysteine），sigma-aldrich；單甘脂（glyceryl monooleate），sigma-aldrich； 維生素C（Ascorbic acid)，sigma-aldrich；酵母粉（yeast)，北京奧博興生物科技有限公司；鳥苷酸二鈉（disodium guanylate），sigma-aldrich；D 葡萄糖酸鈉（sodium gluconate），滬試；酵母抽提物FM802（yeast extract），安琪；無水硫酸鎂，六水氯化鎂，滬試。

1.2 實驗儀器

BSA2202S 電子天平，Sartorius；G20 自動滴定儀、Five Easy pH 計，Mettler Toledo；HH-W600 水浴鍋、數(shù)顯恒溫三用水箱，常州中捷實驗儀器制造有限公司；LDZX-50KBS 立式滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；D2025W 電動攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；APV-1000 高壓均質(zhì)機，漢默泰克（北京）流體技術(shù)有限公司；BCD-268WBC 立式冷藏陳列柜，Haier。

1.3 方法

1.3.1 酸奶的制備

95 g 奶粉加純凈水，定量至1 L；加熱至60～65 ℃，高速攪拌溶解15 min；65～70 ℃、20 MPa 條件下均質(zhì)后于95 ℃條件下殺菌5 min；冷卻至42～43 ℃，接菌并于42～43 ℃溫度下發(fā)酵4～6 h；繼續(xù)42～43 ℃培養(yǎng)至滴定酸度不低于70°T，降溫至20～25℃，灌裝，置于1～4 ℃冷藏約12 h 后檢驗。

1.3.2 酸奶pH 及酸度的測定

酸奶pH 用pH 計測定，酸度采用滴定法測定。測量酸度時，取樣品5 mL，加入20 mL 蒸餾水，采用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液（約0.1 mol/L）滴定至微紅色，30 s不褪色即為滴定終點，所用的NaOH 的毫升數(shù)乘以20，即得出吉爾涅爾度（°T)。

1.3.3 酸奶發(fā)酵的影響因素

酸奶發(fā)酵的影響因素有：菌種關(guān)系及比例（不同的發(fā)酵劑）[8-9]、發(fā)酵促進劑（抗氧化劑等）的添加及對水分活度的影響[1,9-10]、酶的添加[9,11-12]、乳化劑的添加[5-6]、生長因子的添加等[3-4,10]。本文比較不同的發(fā)酵劑（GF931、GF686、GF359、GF377）對發(fā)酵差別的影響，以及添加抗氧化劑（維生素C、L-半胱氨酸）、酶（β-半乳糖苷酶、菠蘿酶、木瓜酶、胰酶）、乳化劑（單甘酯）、生長因子（酪蛋白水解物、番茄粉、酵母粉、酵母抽提物）、鳥苷酸二鈉、葡萄糖酸鈉等對發(fā)酵酸度、pH、質(zhì)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長因子對酸奶發(fā)酵pH 的影響

乳酸菌的快速增殖會產(chǎn)酸，降低體系的pH。有研究表明，在培養(yǎng)基中分別添加番茄汁、緩沖鹽碳酸鈣、啤酒、CaCl2、麥芽汁、胡蘿卜汁等，對菌體的生長有促進作用[3-4]，而抗氧化劑（維生素C、L-半胱氨酸）的添加可能在維持益生菌細(xì)胞中有效[1,10]。本研究在酸奶發(fā)酵過程中（發(fā)酵劑GF931）添加生長因子（酪蛋白水解物、番茄粉、酵母粉）和抗氧化劑（L-半胱氨酸、維生素C）、乳化劑（單甘酯）、鳥苷酸二鈉、葡萄糖酸鈉進行比較實驗，結(jié)果如圖1 所示。番茄粉、酪蛋白水解物、維生素C、酵母粉對pH 的影響較大，這可能是因為酪蛋白經(jīng)水解后富含氨基酸和肽類，可以更好地促進菌體生長，提高了菌體的產(chǎn)酸能力；而番茄粉對酸奶發(fā)酵的促進作用進一步證實了張?zhí)m威等人[3]的研究，即番茄汁可以促進保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長；酵母粉含有大量氨基酸，可以促進菌體生長，因而可以提高酸奶的發(fā)酵速度。相比較而言，單甘酯和L-半胱氨酸對pH 降幅也有一定的增加作用，鳥苷酸二鈉和葡萄糖酸鈉則能減緩pH的下降。

圖1 生長因子添加對酸奶發(fā)酵pH 的影響（發(fā)酵劑GF931）

2.2 酶添加對酸奶發(fā)酵質(zhì)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)種類和含量、脂肪含量是決定酸奶質(zhì)構(gòu)的基礎(chǔ)[5]，此外，胞外多糖的產(chǎn)生也會對酸奶的粘度及質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響[8]。酶的添加會改變蛋白質(zhì)的組成和比例，因而會對酸奶質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，同種蛋白質(zhì)經(jīng)過不同的蛋白酶水解后其水解物中各氨基酸和肽的含量和種類差異均較大，不同蛋白質(zhì)的水解物能提供的氨基酸的種類和含量也有差異，因而不同酶的水解物對酸奶發(fā)酵劑的促進作用有差異[11]。

兩種酶（木瓜酶、菠蘿酶）的添加對酸奶發(fā)酵質(zhì)構(gòu)的影響見圖2。實驗表明，酶解處理的牛奶發(fā)酵的酸奶的物理性質(zhì)變化很大，不同的酶產(chǎn)生的效果也有差別。當(dāng)木瓜酶添加量為10 mg/L 和20 mg/L 時，對發(fā)酵劑GF931 發(fā)酵的酸奶質(zhì)構(gòu)影響不大；而當(dāng)其添加量增加至40 mg/L 時，1 h 開始凝塊，4 h 嚴(yán)重析出乳清。菠蘿酶添加2 mg/L 時，3 h 即開始凝塊有乳清；而添加量8 mg/L 時，發(fā)酵3 h 則嚴(yán)重凝塊有乳清。

圖2 酶添加對酸奶發(fā)酵質(zhì)構(gòu)的影響（發(fā)酵劑GF931）

2.3 發(fā)酵促進劑相同添加量比較實驗

表1 為添加量30 mg/L 的單因素實驗結(jié)果（發(fā)酵劑GF931）。從表1 可以看出，除了L-半胱氨酸和MgSO4會使發(fā)酵乳口感異常，其他因素均對發(fā)酵乳的口感沒有明顯影響，菠蘿酶對發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)影響較大，狀態(tài)比較差，其他發(fā)酵促進劑的發(fā)酵后狀態(tài)均為良好。β-半乳糖苷酶的添加反而使發(fā)酵后pH 增加，這可能是由于這種酶對牛奶中的蛋白分解能力不強或者其分解的產(chǎn)物不能夠被乳酸菌所利用造成的。因此，雖然β-半乳糖苷酶細(xì)胞內(nèi)可以分解乳糖，菌體外添加并沒有對發(fā)酵有明顯的促進作用。

表1 單因素實驗結(jié)果

2.4 綜合因素對不同發(fā)酵劑的影響

圖3 pH 和酸度隨發(fā)酵時間的變化

為了比較酶和生長因子混合添加對酸奶發(fā)酵過程中酸度和pH 的影響，采用發(fā)酵活性較高的發(fā)酵劑GF686，添加不同含量的木瓜酶和酵母抽提物，并記錄對酸奶發(fā)酵pH 和酸度的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，滴定酸度逐漸增大，原因可能是菌體的增殖產(chǎn)生酸性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)經(jīng)過酶水解產(chǎn)生的氨基酸和短肽增加了嗜熱鏈球菌的產(chǎn)酸能力[11]。雖然木瓜酶和酵母抽提物的添加能夠在一定程度上提高酸奶發(fā)酵速度，但總體來講，促進效果不明顯，且無劑量依賴性。因此，雖然木瓜酶和酵母抽提物在單因素實驗中對發(fā)酵促進效果明顯，此發(fā)酵促進劑對發(fā)酵活性相當(dāng)高的發(fā)酵劑GF686 并無明顯作用。

表2 為3 種發(fā)酵劑（GF359、GF377、GF686）中，分別添加混合生長因子Ⅰ（木瓜酶1 mg/L ＋胰酶1 mg/L ＋酪蛋白水解物10 mg/L ＋番茄粉10 mg/L ＋酵母抽提物7 mg/L ＋單甘脂1 mg/L）、生長因子Ⅱ（10 mg/L MgCl2）、生長因子Ⅲ（30 mg/L MgCl2）對發(fā)酵的影響。從表2 可以得出，組合Ⅰ對發(fā)酵活性偏低的發(fā)酵劑GF359 有明顯的發(fā)酵促進作用而對發(fā)酵活性中等的發(fā)酵劑GF377（medium）和發(fā)酵活性高的發(fā)酵劑（GF686）均無明顯發(fā)酵促進作用。MgCl2對發(fā)酵活性低的發(fā)酵劑GF359 也無明顯促進作用。

表2 不同發(fā)酵劑發(fā)酵差別比較

3 結(jié)論

在酸奶發(fā)酵過程中添加生長因子番茄粉、酪蛋白水解物、酵母粉、酵母抽提物以及抗氧化劑維生素C對發(fā)酵pH 的變化影響較大，而乳化劑單甘酯、抗氧化劑L-半胱氨酸對發(fā)酵酸奶的pH 影響不大；菠蘿酶和β-半乳糖苷酶對pH 影響不大，木瓜酶對pH影響顯著；鳥苷酸二鈉和葡萄糖酸鈉則減緩發(fā)酵速度。木瓜酶和菠蘿酶在高劑量時對酸奶質(zhì)構(gòu)有不良影響；L-半胱氨酸和MgSO4會對酸奶發(fā)酵味道產(chǎn)生異味。通過聯(lián)合配比酶、生長因子和乳化劑，可以得出發(fā)酵促進劑的最佳多因素組合，從而在不影響酸奶質(zhì)構(gòu)和口感的前提下，達(dá)到最優(yōu)促發(fā)酵效果。發(fā)酵促進劑對發(fā)酵活性較高的發(fā)酵劑并無明顯作用，而對發(fā)酵活性較低的發(fā)酵劑有明顯促進作用。