連澤鈺,彭俊杰,郭延煦,王淑凡,馮亞莉,翟廣玉
(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,河南鄭州 450001)
槲皮素是一種類黃酮,由于其促進(jìn)健康的功效,已引起營養(yǎng)學(xué)家和藥物化學(xué)家的關(guān)注[1]。槲皮素是一種天然抗氧化劑,具有重要的生物活性,對多種疾病具有化學(xué)預(yù)防和治療作用,可抗癌、抗炎、抗病毒、抗阿爾茨海默病、抗糖尿病及其并發(fā)癥、心血管保護(hù)等[2]。槲皮素對腫瘤細(xì)胞具有直接促凋亡作用,因此可以抑制許多人類癌癥的進(jìn)展。槲皮素溶解性差、體內(nèi)代謝快、半衰期短、生物利用度低等特點(diǎn),限制了其臨床應(yīng)用。以槲皮素為先導(dǎo)化合物,對其做結(jié)構(gòu)修飾,可改善其生物利用度,槲皮素酯類衍生物就是其中重要的一類[3]。
以蘆丁為原料,經(jīng)過芐基保護(hù)、酸水解、酯化、Pd/C 加氫脫保護(hù),合成了9 個(gè)槲皮素-3-O-?;パ苌铮Y(jié)構(gòu)修飾后,其體外抗腫瘤活性顯著增強(qiáng),是具有抗腫瘤潛力的新型化合物。
400 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀(DMSO-d6或CDCl3為溶劑,TMS 為內(nèi)標(biāo)),德國Bruker 公司生產(chǎn);UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì),日本島津公司生產(chǎn);ZQ24000/2695 四級桿LC/MS 聯(lián)用儀,美國Waters 公司生產(chǎn);IS10 型紅外光譜儀,KBr 壓片,美國尼高力公司生產(chǎn);RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);HJ-3 型恒溫磁力加熱攪拌器,常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn);ZW-3 型紫外分析儀,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);XD-101 型倒置顯微鏡,上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);酶聯(lián)反應(yīng)檢測儀,美國Bio Tek 公司生產(chǎn)。槲皮素、蘆丁,購自河南平輿馨星生化有限公司;Pd/C,購自上海晶純試劑有限公司;其他溶劑均為分析純。
1.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
用MTT 法檢測EC109 食管癌細(xì)胞、MGC803 胃癌細(xì)胞、EJ 結(jié)腸癌細(xì)胞,觀察不同濃度的槲皮素及其酯類化合物對其增殖的抑制作用。取分化成熟狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞,調(diào)整濃度為6×103個(gè)/孔,接種于96 孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL。待細(xì)胞貼壁,實(shí)驗(yàn)組加入RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋的槲皮素酯,濃度分別為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、8.0 μg/mL、16.0 μg/mL、32.0 μg/mL 和64.0 μg/mL。空白實(shí)驗(yàn):溶劑對照組加入相同量培養(yǎng)基,每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h 后,取出培養(yǎng)板,在倒置顯微鏡下觀察拍照。再加入MTT(20 μL/孔)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,倒掉原培養(yǎng)液以后,使用PBS清洗每孔,加入DMSO(150 μL/孔),振搖均勻使沉淀完全溶解。室溫下放置20 min 后,在酶標(biāo)儀上檢測570 nm 處每孔光吸收度數(shù)值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,取平均值。并按公式(1)計(jì)算生長抑制率GI:
利用SPPS19.0 計(jì)算IC50值。
1.2.2 化合物的合成
1.2.2.1 中間體7,3',4'-O-三芐基槲皮素(1)的合成
稱取2.44 g 蘆丁溶于20 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,加入1.93 g 無水碳酸鉀和催化量碘化鉀,至完全溶解,冰水浴下逐滴滴加1.6 mL 溴化芐,升至室溫后繼續(xù)反應(yīng)24 h。加入鹽酸調(diào)pH 至6,加適量蒸餾水,有沉淀析出,棄上清液。固體中加入50 mL無水乙醇,水浴加熱至完全溶解,加入8 mL 濃鹽酸,加熱回流,至有沉淀產(chǎn)生,冷卻,冰箱放置過夜,過濾,烘干,得粗品,用CHCl3/CH3OH 重結(jié)晶,干燥,得黃色固體,產(chǎn)率78%。
1.2.2.2 部分保護(hù)槲皮素酯類衍生物(2)的合成
7,3',4'-O-三芐基槲皮素-3-O-苯甲酸酯(2a)的合成:稱取1.144 g 化合物1,溶于40 mL 二氯甲烷中,加入0.337 g 苯甲酰氯,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5 h。反應(yīng)液分別用飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌3 次,無水硫酸鈉干燥,粗品用CHCl3/CH3OH 重結(jié)晶,干燥,得到淡黃色固體,產(chǎn)率80%。
7,3',4'-O-三芐基槲皮素-3-O-鄰甲基苯甲酸酯(2b)的合成:稱取1.144 g 化合物1,溶于40 mL無水二氯甲烷中,加入0.371 g 鄰甲基苯甲酰氯,加入適量二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)做催化劑,攪拌反應(yīng)5 h。將反應(yīng)液放置冰箱冷藏1 h,過濾除掉生成的二環(huán)己基脲(DCU)。濾液分別用飽和碳酸氫鈉、稀鹽酸、飽和食鹽水洗滌3 次,無水硫酸鈉干燥,粗品用CHCl3/CH3OH 重結(jié)晶,干燥,得淡黃色固體,產(chǎn)率60%。
2c~2i 的合成方法同2b,此處省略。
1.2.2.3 槲皮素酯類衍生物(3)的合成
(1)槲皮素-3-O-苯甲酸酯(3a)的制備
取1.325 g 7,3',4'-O-三芐基槲皮素-3-O-苯甲酸酯溶于二氯甲烷/甲醇混合溶劑中,加入5%的Pd/C 0.159 g,室溫0.4 MPa 壓力條件下,加氫反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后,過濾除去Pd/C,旋蒸回收溶劑,得固體,以氯仿-甲醇(20 ∶1)為洗脫劑,過短柱,得到淡黃色固體,產(chǎn)率81%,m.p.: 220.4~222.1 ℃;ESI-MS: 407 [M+H]+;1H NMR (400 MHz, DMSO), δ:12.17(s, 1H, 5-OH), 11.00(s, 1H, 7-OH), 9.88(s, 1H,3'-OH), 9.57(s, 1H, 4'-OH), 8.20~8.11(m, 2H, Ar-H),7.78(d, J=7.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.63(t, J=7.8 Hz, 2H,Ar-H), 7.38(d, J=2.2 Hz, 1H, 2`-H), 7.32(dd, J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6'-H), 6.87(d, J=8.4 Hz, 1H, 5'-H), 6.52(d, J=2.0 Hz, 1H, 8-H), 6.28(d, J=2.0 Hz, 1H, 6-H)。
槲皮素-3-O-鄰甲基苯甲酸酯(3b)的制備方法同3a。產(chǎn)率63.1%,黃色固體,m.p.: 182.7~185.2℃; ESI-MS: 420.0 [M-H]+,1H NMR (400 MHz, DMSO),δ: 11.37(s, 1H, 5-OH), 10.77(s, 1H, 7-OH), 9.83(s, 1H,3'-OH), 9.47(s, 1H, 4'-OH), 8.28~8.36(m, 2H, Ar-H),8.21(d, J=7.5 Hz, 1H, Ar-H), 8.02(t, J=7.8 Hz, 2H,Ar-H), 7.96(d, J=2.2 Hz, 1H, 2'-H), 7.56 (dd, J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6'-H), 7.32(d, J=8.4 Hz, 1H, 5-H), 6.95(d, J=2.0 Hz, 1H, 8-H), 6.55(d, J=2.0 Hz, 1H, 6-H), 2.56(t, J=7.5 Hz, 3H, CH3)。
槲皮素-3-O-間甲基苯甲酸酯(3c),產(chǎn)率56.8%,黃色固體,m.p.: 203.5~207.1 ℃; ESI-MS:421.5[M+H]+。
槲皮素-3-O-對甲基苯甲酸酯(3d),產(chǎn)率61.3%,黃色固體,m.p.: 216.6~218.5 ℃; ESI-MS:421.7[M+H]+;氫譜略。
槲皮素-3-O-鄰氯苯甲酸酯(3e),產(chǎn)率52.8%,黃色固體,m.p.: 198.4~199.8 ℃; ESI-MS: 440.5[M-H]+。
槲皮素-3-O-間氯苯甲酸酯(3f),產(chǎn)率48.6%,黃色固體,m.p.: 189.1~190.6 ℃; ESI-MS: 440.5[M+H]+。
槲皮素-3-O-對氯苯甲酸酯(3g),產(chǎn)率53.5%,黃色固體,m.p.: 178.5~180.6 ℃; ESI-MS: 440.5 [M+H]+。
槲皮素-3-O-對硝基苯甲酸酯(3h),產(chǎn)率61.6%,黃色固體,m.p.: 215.9~217.2 ℃; ESI-MS: 452.3 [M+H]+。
槲皮素-3-O- 間硝基苯甲酸酯(3i),產(chǎn)率51.8%,黃色固體,m.p.: 206.7~210.3 ℃; ESI-MS:452.1[M+H]+。
槲皮素-3-O-酸酯類衍生物的合成路線如圖1所示。參照文獻(xiàn)[4],優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,在室溫下反應(yīng)24 h。一方面可以避免原料自身的聚合反應(yīng),另一方面低溫不易破壞5-羥基與4-羰基形成的氫鍵,由于氫鍵具有方向性和飽和性,這意味著即便3 羥基和5 羥基同時(shí)存在,在下一步酯化過程中,會選擇性的發(fā)生在3位羥基上,因此得到的最終產(chǎn)物以三為主,存在少部分二芐基槲皮素。通過氯仿/甲醇重結(jié)晶,得到較純的中間體7,3',4'-O-三芐基槲皮素。與酰氯或酸酐酯化得到化合物2,催化氫解脫保護(hù)基得到目標(biāo)產(chǎn)物3(a~i)。
槲皮素-3-O-?;Σ煌[瘤細(xì)胞的增殖抑制作用見表1。從表1 可以看出,3b 對EC109食管癌細(xì)胞具有較好的抑制作用,比母藥槲皮素更好,3c、3f 與槲皮素相當(dāng),其他化合物效果較差;對MGC803 胃癌細(xì)胞抑制作用都不好,不如母體槲皮素;對于EJ 結(jié)腸癌細(xì)胞,3b 抑制作用較好,優(yōu)于母體槲皮素;3c、3f 與槲皮素相當(dāng)。3b、3c 和3f 對EC109 食管癌和EJ 結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用較好,不但優(yōu)于槲皮素,還優(yōu)于5-氟尿嘧啶,有望進(jìn)一步開發(fā)成為抗食管癌和結(jié)腸癌的候選藥物。
以蘆丁為原料,合成了9 個(gè)槲皮素酯類衍生物,所有化合物均經(jīng)過紅外、核磁、質(zhì)譜確證。與現(xiàn)有的其他路線相比較,該路線具有選擇性高,反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。MTT 法評價(jià)了九種衍生物對3 種癌細(xì)胞的增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,化合物3b、3c、3f對EC109 食管癌和EJ 結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50值小于槲皮素和5-氟尿嘧啶,有望進(jìn)一步開發(fā)成為抗癌的候選藥物。
圖1 槲皮素-3-O-酸酯類衍生物的合成路線
表1 槲皮素-3-O-?;Σ煌[瘤細(xì)胞的增殖抑制率(IC50)