盧意 卜璐璐 林淡鈺 梁嫣然 井秀娜 陶恩祥

帕金森病（PD）是臨床上常見的一種神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率其次于阿爾茨海默病，中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失和路易體形成是它的主要病理特征。帕金森病的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，受氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等多方面影響，有效抑制細(xì)胞凋亡是改善PD 的主要途徑之一［1］。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）是一種DNA 修復(fù)酶，參與DNA 的損傷識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)等過程［2］，魯卡帕尼是一種常見的PARP 抑制劑，目前已經(jīng)用于卵巢癌等多種癌癥的治療，其通過減少腫瘤細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)起到對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)PARP 抑制劑對(duì)于創(chuàng)傷性顱腦損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，而其對(duì)帕金森病中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡的影響還未有明確的說明［3］。本實(shí)驗(yàn)利用PARP 抑制劑魯卡帕尼干預(yù)魚藤酮對(duì)于SH?SY5Y 細(xì)胞的作用，檢測細(xì)胞的生存率、凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白bcl?2 和bax 的蛋白表達(dá)量，探討PARP 抑制劑魯卡帕尼對(duì)于魚藤酮誘導(dǎo)的SH?SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響，從而希望能對(duì)帕金森病的診治提供新的藥物靶點(diǎn)和思路。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器實(shí)驗(yàn)中所用SHSY?5Y 細(xì)胞即人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞由本課題組長期保存，PARP抑制劑rucaparib 魯卡帕尼購自Biofroxx 公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國thermofisher 公司，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司，全反式維甲酸、Tris base、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自sigma 公司，BCA 法測蛋白試劑盒、SDS?PAGE 凝膠配制試劑盒、RIPA 細(xì)胞裂解液購自上海碧云天科技有限公司，PVDF 膜購自Millipore 公司，Bcl?2、Bax 抗體購自abcam 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)SY?SH5Y 細(xì)胞用含10%的胎牛血清（FBS）及1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，置5%的CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至密度達(dá)到70%-80%時(shí)用胰酶消化按1∶5 比例傳代，傳代時(shí)加入維甲酸至終濃度20 μmol/ml 誘導(dǎo)分化7天后作為體外細(xì)胞神經(jīng)元模型使用。

1.3 細(xì)胞分組處理取對(duì)數(shù)生長期的SH?SY5Y細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組以及魯卡帕尼三組，用胰酶消化正處于對(duì)數(shù)生長期的SH?SY5Y 細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后不同分組進(jìn)行不同處理，對(duì)照組細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，魚藤酮組細(xì)胞更換含有10 μmol/L 的魚藤酮的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，魯卡帕尼組更換含有5 μmol/L 魯卡帕尼的新鮮培養(yǎng)基處理1 小時(shí)后向培養(yǎng)基內(nèi)加入魚藤酮至魚藤酮終濃度為10 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 小時(shí)。

1.4 CCK8 檢測細(xì)胞活性細(xì)胞用胰酶消化后調(diào)整濃度為（2-5）×104個(gè)/ml，取100 μl 單細(xì)胞懸液接種于96 孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 小時(shí)后，根據(jù)不同分組進(jìn)行不同處理后，向每孔加入10 μl CCK?8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h 后，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度，按照說明書計(jì)算各組細(xì)胞存活率并進(jìn)行比較。

1.5 Western blot 檢測各組bcl?2、bax 蛋白表達(dá)情況SH?SY5Y 細(xì)胞按每孔2×105個(gè)接種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)分組進(jìn)行不同的加藥處理后，保留細(xì)胞原培養(yǎng)基，胰酶消化離心后得細(xì)胞沉淀，分別提取各組孔內(nèi)細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測各組蛋白濃度進(jìn)行蛋白定量配平，配置10%SDS?PAGE 凝膠進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣量為30 μl，后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5% BSA 封閉一小時(shí)后加入目的蛋白的一抗稀釋液（1∶1 000）4℃搖床過夜，TBST 洗膜后，二抗孵育條帶1 小時(shí)后再次用TBST 清洗條帶后，加入化學(xué)顯影發(fā)光液用Genesystem 軟件顯影，是用Image J 對(duì)得到的蛋白條帶進(jìn)行分析，比較各組bcl?2、bax 蛋白表達(dá)量的差異。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，貼壁后根據(jù)分組進(jìn)行不同的加藥處理后用胰酶消化細(xì)胞，1 000 rpm/min 離心5 分鐘后棄去上清，PBS重懸細(xì)胞后再次離心棄上清，400 μl binding buffer重懸細(xì)胞后將細(xì)胞分為兩管，一管為空白對(duì)照，另一管加入5 μl Annexin V?FITC，混勻后避光孵育15分鐘后，加入10 μl PI 試劑，混勻后用流式細(xì)胞檢測儀檢測細(xì)胞凋亡率，比較各組細(xì)胞凋亡率的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行，定量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 魯卡帕尼對(duì)魚藤酮處理的SH?SY5Y 細(xì)胞活力的影響見圖1。

圖1 魯卡帕尼對(duì)魚藤酮處理的SH?SY5Y 細(xì)胞活力的影響

2.2 魯卡帕尼對(duì)于SH?SY5Y 細(xì)胞bcl?2、bax 蛋白表達(dá)量的影響見圖2。

圖2 魯卡帕尼對(duì)于SH?SY5Y 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 魯卡帕尼對(duì)于魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響如圖3。

圖3 魯卡帕尼對(duì)于魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

細(xì)胞凋亡，即細(xì)胞程序性死亡，是機(jī)體為維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由多種基因調(diào)控的復(fù)雜過程。B 細(xì)胞淋巴瘤?2（B?cell lymphoma?2，Bcl?2）基因家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起重要作用，其包括抗凋亡蛋白（Bcl?2、Bcl?xl、Bcl?w、Mcl?1 等）和促凋亡蛋白（bax、bak、bad、bim 等）［4］。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡會(huì)嚴(yán)重影響正常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程以及導(dǎo)致一系列神經(jīng)退行性疾病。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與帕金森病人中腦黑質(zhì)神經(jīng)元丟失密切相關(guān)。

魯卡帕尼是作用靶點(diǎn)為PARP?1 的PARP 抑制劑，PARP?1 是PARP 蛋白家族中起DNA 修復(fù)作用的重要組成部分，主要通過堿基切除修復(fù)對(duì)DNA單鏈損傷進(jìn)行修復(fù)［5，6］。1985年，Berger發(fā)現(xiàn)DNA的過度損傷會(huì)引起PARP 的過度激活造成細(xì)胞ATP的大量丟失而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［7］，同時(shí)PARP 的過度激活也會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)和細(xì)胞凋亡［6］。PARP 抑制劑對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用已經(jīng)引起眾多神經(jīng)學(xué)者的關(guān)注，目前已有研究證明PARP 抑制劑可改善小鼠顱腦損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)功能障礙及急性神經(jīng)元退行性病變［8］。

綜上所述，本研究通過研究魯卡帕尼對(duì)于魚藤酮誘導(dǎo)的SH?SY5Y 細(xì)胞的凋亡發(fā)現(xiàn)其對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制作用，且對(duì)PD 模型細(xì)胞的死亡有逆轉(zhuǎn)作用。這為帕金森病的研究提供了新的思路，對(duì)PD 藥物的研制提供了新靶點(diǎn)。