張曉丹 1，徐毅 1，杜德奇 1，郭瑩 2，王魯文

（鄭州市婦幼保健院 1.產(chǎn)科；2.婦科，河南鄭州 450000；3.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，河南鄭州 450000）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的3種惡性腫瘤之一，在婦科中死亡率最高[1]。臨床上對于早期宮頸癌的治療多以手術(shù)切除為主，輔以化學(xué)療法、中藥和生物療法[2]。盡管在診斷技術(shù)和治療方法上取得了長足進(jìn)步，但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，宮頸癌患者的長期生存率仍然很差，5年生存率僅為50%～70%[3]。因此，迫切需要找到宮頸癌的新型治療靶標(biāo)和診斷生物標(biāo)記物。

三結(jié)構(gòu)域蛋白59（tripartite motif?containing 59，TRIM59），是三結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲中發(fā)揮著重要作用[4]。TRIM59可作為癌基因，在胃癌、肝癌、肺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中高表達(dá)[5]。已有研究表明，TRIM59在宮頸癌中高表達(dá)，TRIM59敲低可引起S期細(xì)胞周期阻滯[6]。但TRIM59在宮頸癌中的具體作用機(jī)制尚不清楚，本文旨在探究沉默TRIM59對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲與遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基（11965?175）、胎牛血清（10099?141）、青‐鏈 霉 素（15140?122）和 胰 蛋 白 酶（25200?056）購自美國Gibco公司；shRNA TRIM59載體、shRNA?NC由上海生工生物工程股份有限公司合成；Transwell（PIEP12R48）購自美國Millipore公司；Annexin V?FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1062S）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（A0208）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗單克隆抗體TRIM59（ab69639）、Ki67（ab15580）、c?Myc（ab39688）、PC‐NA（ab18197）、Bax（ab104156）、Bcl?2（ab194583）、Caspase?3（ab13847）和Actin（ab5694）購 自 英 國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞株來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中用高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青‐鏈霉素）培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基，收集細(xì)胞時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，試驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞處理及分組

為了防止脫靶效應(yīng)，設(shè)計(jì)了3對shRNA序列（TRIM 59-shRNA1:5'-GGAAGCTGTTCTCCAGTAT-3';TRIM59-shRNA2:5'GAAGAGTCTCCACTTAAAT-3';TRIM59-shRNA3:5'-GAATGGAGCAGAACAGAAA-3'）干擾TRIM59的表達(dá)，通過RT?PCR和Western blot檢測選擇干擾效果最好的TRIM59?shRNA2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。取對數(shù)生長期SiHa細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：Control組、shRNA?NC組 和TRIM59?shRNA2組。Control組不做處理，shRNA?NC組轉(zhuǎn)染shR‐NA?NC陰性對照載體，TRIM59?shRNA2組轉(zhuǎn)染TRIM59?shRNA2慢病毒載體。

1.4 RT?PCR

用Trizol法從SiHa細(xì)胞中提取總RNA，采用PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。以Actin為內(nèi)參基因，用2?△△Ct計(jì)算各目的基因相對表達(dá)量。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)SiHa細(xì)胞培養(yǎng)4 d，吹散為單個(gè)細(xì)胞，用6孔板培養(yǎng)，約500個(gè)細(xì)胞每孔，培養(yǎng)14 d，棄掉培養(yǎng)基，用乙醇固定30 min，接著用0.5%結(jié)晶紫染色，用去離子水漂洗晾干，進(jìn)行拍照觀察觀察克隆形成數(shù)目，計(jì)算克隆形成率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集SiHa懸浮細(xì)胞到10 mL的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為3×106/mL，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞后室溫避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞后孵育緩沖液洗1次，加入熒光（SA?FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光振動(dòng)，通過流式細(xì)胞儀上機(jī)分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488 nm，波長515 nm檢測FITC熒光，波長大于560 nm檢測PI。

1.7 Western blot檢 測Ki67、PCNA、c?Myc、Bax、Bcl?2和Caspase?3蛋白表達(dá)水平

取各組對數(shù)生長期SiHa細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白質(zhì)樣品，100℃變性5 min后用SDS?PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4℃條件下加入Ki67、PCNA、c?Myc、Bax、Bcl?2和Caspase?3一抗并孵育過夜，清洗，然后在4℃下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，孵育2 h，最后加入ECL發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。以目的條帶灰度值/Actin灰度值表示蛋白表達(dá)水平。

1.8 Transwell檢測細(xì)胞侵襲

4℃下取60μL Matrigel加入300μL無血清培養(yǎng)基中混勻，平均加入小室，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，將100μL細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基清洗3次，配成細(xì)胞懸液加入Transwell下室，小室中加入600μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell小室用PBS沖洗2次，5%戊二醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色0.5 h后于熒光顯微鏡下觀測，隨機(jī)選擇5個(gè)視野對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，侵襲細(xì)胞數(shù)為每視野的平均細(xì)胞數(shù)。

1.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移

取對數(shù)生長期的各組SiHa細(xì)胞，接種于6孔板中培養(yǎng)48 h，待生長至密度>95%時(shí)，使用滅菌槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)板上劃痕，劃痕后用PBS洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板，再加入無血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。于0和24 h取樣并拍照，劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度?24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，兩組間比較采取t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM59 mRNA和蛋白表達(dá)水平

通過RT?PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞TRIM59 mRNA和蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖1所示，與Control組比較，TRIM59?shRNA1組、TRIM59?shRNA2組和TRIM59?shRNA3組細(xì)胞TRIM59 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。選擇TRIM59?shRNA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 TRIM59 mRNA和蛋白表達(dá)水平Figure 1 Expression of TRIM59 mRNA and protein

2.2 沉默TRIM59降低SiHa細(xì)胞克隆形成率

通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成率結(jié)果如圖2所示，與Control組比較，TRIM59?shR‐NA2組細(xì)胞克隆形成率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞克隆形成率的影響Figure 2 Effect of silencing TRIM59 on the clonal formation rate of SiHa cells

2.3 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的影響

通過Western blot檢測各組細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖3所示，與Control組比較，TRIM59?shRNA2組Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的影響Figure 3 Effect of silencing TRIM59 on the expression of Ki67 and PCNA protein in SiHa cells

2.4 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞凋亡率的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖4所示，與Control組比較，TRIM59?shRNA2組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞凋亡率的影響Figure 4 Effect of silencing TRIM59 on the apoptosis rate of SiHa cells

2.5 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞c?Myc蛋白表達(dá)水平、cleaved Caspase?3/Caspase?3、Bax/Bcl?2的影響

通過Western blot檢測各組細(xì)胞c?Myc、Bax、Bcl?2和Caspase?3蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖5所示，與Control組比較，TRIM59?shRNA2組c?Myc蛋白表達(dá)水平降低，cleaved Caspase?3/Caspase?3、Bax/Bcl?2比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞c-Myc、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響Figure 5 Effect of silencing TRIM59 on the expression of C-Myc,Bax,Bcl-2 and Caspase-3 protein in SiHa cells

2.6 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的影響

通過Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)結(jié)果如圖6所示，與Control組比較，TRIM59?shRNA2組侵襲細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的影響Figure 6 Effect of silencing TRIM59 on the number of invasive cells in SiHa cells

2.7 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞劃痕愈合率的影響

通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞劃痕愈合率結(jié)果如圖7所示，與Control組比較，TRIM59?shR‐NA2組劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖7 沉默TRIM59對SiHa細(xì)胞劃痕愈合率的影響Figure 7 Effect of silencing TRIM59 on the scratch healing rate of SiHa cells

3 討論

宮頸癌是婦科腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率逐年遞增，嚴(yán)重威脅女性健康[7]。相關(guān)研究表明TRIM59可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，可作為腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)[8]。深入研究TRIM59可為宮頸癌分子靶向診斷和治療提供新的策略。

癌細(xì)胞過度增殖是宮頸癌病灶內(nèi)重要的生物學(xué)特征，即抑制癌細(xì)胞增殖是治療宮頸癌的必要方式。Ki67是存在于細(xì)胞增殖期的蛋白質(zhì)，位于10號染色體上，與細(xì)胞增殖有關(guān)，在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[9]。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear an‐tigen,PCNA)是與細(xì)胞增殖周期有關(guān)的周期蛋白，是一種較好的判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)記，應(yīng)用免疫組化方法檢測PCNA是研究腫瘤細(xì)胞增殖活性的常用方法,表達(dá)強(qiáng)意味著腫瘤細(xì)胞處于增殖期[10]。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的TRIM59基因沉默是肝癌的增殖、遷移、侵襲受到抑制。本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默TRIM59具有降低SiHa細(xì)胞克隆形成率及Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的作用，提示TRIM59抑制SiHa細(xì)胞增殖。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡，治療癌癥的化學(xué)預(yù)防策略之一就是誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡。Bax和Bcl?2屬于Bcl?2基因家族成員，Bcl?2為凋亡抑制基因，Bax為促凋亡基因，Bax/Bcl?2比值越高，凋亡狀況越嚴(yán)重[12]。Caspase?3是Caspase家族中的一員，屬于細(xì)胞凋亡蛋白，激活后能直接水解細(xì)胞體內(nèi)相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不可逆凋亡[13]。c?Myc蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，宮頸癌組織中伴隨有c?Myc的過度表達(dá)和擴(kuò)增[14]。Sun等[15]研究發(fā)現(xiàn)TRIM59敲低可以抑制Bcl?2的表達(dá)，增強(qiáng)Bax的表達(dá)，提示TRIM59可能通過線粒體途徑影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默TRIM59具有降低SiHa細(xì)胞c?Myc蛋白表達(dá)水平，升高cleaved Caspase?3/Caspase?3、Bax/Bcl?2比值的作用。提示TRIM59誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。

局部侵襲和遠(yuǎn)處遷移是限制臨床外科手術(shù)治療宮頸癌的重要原因之一，因此降低宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力可以增強(qiáng)宮頸癌的治療效果[16]。趙凱等[17]研究發(fā)現(xiàn)沉默TRIM59可通過抑制EMT過程抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲。本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默TRIM59具有降低SiHa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)及劃痕愈合率的作用。提示沉默TRIM59抑制SiHa細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述，沉默TRIM59可抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本文為TRIM59于臨床治療和診斷宮頸癌提供新的研究思路，但TRIM59在宮頸癌中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。