潘姝，姜珊珊，原永芳

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

吉西他濱(gemcitabine,Gem)是胰腺癌的一線用藥[1]。除了細胞毒性，吉西他濱還具有免疫調節(jié)作用。如吉西他濱可選擇性作用于調節(jié)性T細胞、B淋巴細胞等[2]。然而，吉西他濱對巨噬細胞的作用尚未見報道。

基于巨噬細胞的免疫療法相比放療、化療及手術療法具有更好的療效及耐受性[3]。巨噬細胞約占實體瘤免疫細胞總量的5%～40%，是種類最豐富的免疫細胞[4]。研究表明，M1型巨噬細胞在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要的作用[5]。巨噬細胞通過內吞、分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、IL-6、IL-1及產(chǎn)生NO及活性氧來發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。本研究擬探討吉西他濱對M1型巨噬細胞功能的影響，并對其機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑

1.1.1 細胞及培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞Ana-1購自中國科學院上海生物化學與生物學研究所細胞庫。細胞培養(yǎng)于含10%（φ）FBS及1%青霉素鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，細胞放置于含5%（φ）CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.1.2 材料與試劑 鹽酸吉西他濱購自上海源葉生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒及Griess試劑購自碧云天生物科技研究所；IFN-γ購自塞業(yè)生物科技有限公司；LPS購自Sigma-Aldrich公司；TNF-α和IL-6檢測試劑盒購自上海船夫生物技術有限公司；ROS檢測試劑盒購自凱基生物技術股份有限公司；FcRγ組織劑（FCGR2/CD32和FCGR/CD16）和PE-conjugated I-A/I-E抗體購自BD公司；LC3-Ⅱ和β-actin購自Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔免疫球蛋白G二抗購自上海明睿生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞吞噬實驗 將巨噬細胞Ana-1培養(yǎng)在共聚焦皿里，300 IU/mL的IFN-γ和100 ng/mL的LPS及100 ng/mL吉西他濱在37℃環(huán)境下共同處理24 h。100 mg/L酵母聚糖孵育2 h，激光共聚焦下觀察巨噬細胞的吞噬情況。

1.2.2 細胞周期分析 細胞經(jīng)藥物處理后，收集細胞，預冷PBS洗2次，70%（φ）乙醇4℃下固定過夜，PBS洗2次，根據(jù)試劑盒說明書加入PI染色液，37℃避光孵育20 min后，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.3 透射電子顯微鏡分析 將處于對數(shù)生長期的細胞以5×103/孔的密度種于6孔板中，用適當濃度藥物處理一定時間，收集細胞，用含2%戊二醛的培養(yǎng)基固定15 min，1 500 r/min離心，棄去培養(yǎng)基，小心加入1 mL固定液固定過夜，0.1 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，用乙醇梯度脫水，60℃放置48 h，在透射電子顯微鏡下觀察其超微結構。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察 Ana-1細胞以1×105個/mL的密度種于6孔板中，經(jīng)藥物處理后，無血清培養(yǎng)基洗2遍后用染料Hoechst 33342（藍色熒光），自噬檢測試劑Cyto-ID?（綠色熒光）及ROS檢測試劑Mito Sox（紅色熒光）避光孵育15 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 細胞上清液NO水平檢測 將巨噬細胞Ana-1接種于96孔板中，藥物處理后，根據(jù)NO檢測試劑盒說明書，用培養(yǎng)基將標準品稀釋成一定的濃度梯度（0、1、5、10、20、40、60、100μmol/L），在96孔板中加入50μL標準品及細胞上清液，再加入50μL Griess Reagent I和50μL Griess ReagentⅡ，酶標儀在540 nm波長下檢測吸光度(A)值。

1.2.6 ROS表達水平檢測 將巨噬細胞Ana-1接種至黑色96孔培養(yǎng)板中，藥物處理后，去除細胞培養(yǎng)液，加入50μL的10μmol/L DCFH-DA，37℃細胞孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，應用熒光酶標儀檢測吸光度值。

1.2.7 Elisa檢測上清液免疫因子表達水平 將巨噬細胞Ana-1接種至24孔板中，藥物處理后，吸取100μL細胞上清液或標準品加入Elisa反應板中，標準品按照以下濃度繪制標準曲線（500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 pg/mL）。每孔加入50μL生物素化抗體工作液，封板條封住反應孔，孵育120 min，洗滌4次，除空白孔外，每孔加入100μL顯色液，黑暗條件下孵育20 min，隨后加入100μL終止液，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值。

1.2.8 MHC-Ⅱ表達水平檢測 巨噬細胞Ana-1經(jīng)藥物處理后用200μL培養(yǎng)基重懸，加入4μL FcRγ阻滯劑（FCGR2/CD32和FCGR3/CD16），37℃孵育5 min，隨后加入4μL PE-conjugated I-A/I-E抗體，37℃孵育30 min，流式細胞儀檢測MHC-Ⅱ表達水平。

1.2.9 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達水平 將對數(shù)期細胞以5×103/孔的密度種于6孔板中，藥物作用特定時間后，收集細胞，用預冷的0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）洗滌2次，用RIPA裂解液重懸并裂解細胞，冰上放置30 min待細胞充分裂解，4℃下12 000 r/min離心5 min收集上清液。每孔上樣等量蛋白并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜并用含5%牛血清蛋白的TBST進行封閉1.5 h，一抗孵育過夜后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次后ECL化學發(fā)光顯色試劑盒進行顯色，觀察凋亡相關蛋白的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計分析與作圖，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 吉西他濱對巨噬細胞功能的影響

Ana-1小鼠巨噬細胞被IFN-γ/LPS誘導成M1型巨噬細胞[7]，觀察吉西他濱對M1型巨噬細胞周期及吞噬作用的影響。如圖1A～圖1B所示，與對照組相比，吉西他濱能夠抑制M1型巨噬細胞周期S期阻滯。激光共聚焦顯微鏡觀察吉西他濱對巨噬細胞吞噬作用的影響。如圖1C所示，IFN-γ/LPS誘導的巨噬細胞具有較強的吞噬作用，聯(lián)合吉西他濱后，吞噬作用被抑制。結果表明吉西他濱能夠抑制M1型巨噬細胞的功能。

圖1 吉西他濱抑制Ana-1細胞周期和吞噬Figure 1 Gemcitabine inhibits cell cycle and phagocytosis of ANA-1 cells

2.2 吉西他濱對Ana-1細胞自由基的作用

Ana-1細胞中的DNA用Hoechst33324（藍色熒光）標記，ROS用Mito Sox（紅色熒光標記）。結果如圖2A所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細胞紅色熒光明顯增強，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細胞，紅色熒光明顯減弱。隨后，DCFH-DA標記ROS，熒光酶標儀下檢測ROS熒光強度。結果如圖2B所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱后，Ana-1細胞的ROS水平顯著降低（P<0.05）。隨后，檢測吉西他濱對Ana-1細胞產(chǎn)生NO的影響。結果如圖2C所示，IFN-γ和LPS誘導的NO水平約為對照組的2.5倍，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱誘導產(chǎn)生的NO水平約為對照組的1.5倍。表明吉西他濱能抑制活化的局勢細胞產(chǎn)生NO（P<0.01）。

ELISA檢測TNF-α和IL-6在巨噬細胞中的表達。結果如圖2D～圖2E所示，IFN-γ和LPS誘導Ana-1產(chǎn)生TNF-α和IL-6分別為對照組的3.5和5.2倍。而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱，Ana-1產(chǎn)生TNF-α和IL-6分別為對照組的2和2.6倍，說明吉西他濱能夠抑制活化的巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6。

MHC-Ⅱ參與特異性免疫應答，接下來研究了吉西他濱對巨噬細胞抗原提呈能力的影響。結果如圖2F所示，IFN-γ和LPS誘導的Ana-1細胞MHC-Ⅱ表達水平最高，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱抑制了MHC-Ⅱ的表達。結果表明吉西他濱能夠抑制巨噬細胞抗原提呈能力。

圖2 吉西他濱抑制Ana-1細胞自由基的產(chǎn)生Figure 2 Gemcitabine inhibits free radical production in ANA-1 cells

2.3 吉西他濱對Ana-1巨噬細胞自噬的影響

通過共聚焦顯微鏡和投射電鏡觀察巨噬細胞自噬體的產(chǎn)生。使用Hoechst 33342（藍色熒光）標記活細胞核，Cyto ID（綠色熒光）標記自噬相關蛋白。結果如圖3A所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細胞誘導的綠色熒光顯著增強，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細胞綠色熒光顯著減弱。投射電鏡下能夠明顯觀察到IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細胞有較多的自噬體結構，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細胞自噬體結構明顯減少（圖3B）。最后，用Western blot法檢測自噬相關蛋白LC3的表達情況。結果如圖3C所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細胞LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細胞LC3-Ⅱ表達水平下降。表明，吉西他濱能夠抑制活化的巨噬細胞自噬。

圖3 吉西他濱抑制巨噬細胞自噬Figure 3 Gemcitabine inhibits autophagy in ANA-1 cells

2.4 激活Ana-1細胞自噬逆轉吉西他濱免疫抑制

分別用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導劑海藻糖（Tre）分別處理活化的巨噬細胞，觀察巨噬細胞免疫應答水平。結果如圖4A所示，激活細胞自噬，逆轉了吉西他濱對活化的巨噬細胞抑制。而抑制自噬，巨噬細胞的吞噬功能仍處于較低水平?？疾炀奘杉毎嚓P細胞因子的表達水平，結果如圖4B～圖4D所示，與IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細胞相比，激活細胞自噬后，IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理組的TNF-α、IL-6和MHC-Ⅱ表達水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結果表明，激活巨噬細胞自噬，能夠逆轉吉西他濱對活化的巨噬細胞的免疫抑制。

圖4 激活抑制巨噬細胞自噬逆轉免疫抑制Figure 4 Activation of autophagy reverses immune inhibition in Ana-1 cells

3 討論

吉西他濱是一種嘧啶類抗腫瘤藥物，用于多種實體瘤的化學療法，如胰腺癌和轉移性乳腺癌[8]。然而，吉西他濱的藥物抵抗始終是影響治療成功與否的阻礙。研究表明，一個有效的免疫體系對化療藥物的抗腫瘤療效具有促進作用，而在腫瘤微環(huán)境中，抑制免疫可以促進藥物抵抗[9]。

在腫瘤微環(huán)境中，T細胞和巨噬細胞均可啟動或抑制對腫瘤細胞的免疫進攻[10]?；瘜W療法所產(chǎn)生的免疫增強和免疫抑制作用依賴于藥物種類、劑量、服藥時間和腫瘤類型等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能通過調節(jié)微環(huán)境中的樹突狀細胞和T細胞增強抗腫瘤免疫。而另有研究，吉西他濱可通過激活髓性來源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的炎性通路而選擇性的降低抗腫瘤效果[12]；Sachin等[13]發(fā)現(xiàn)吉西他濱作用于胰腺癌細胞后，腫瘤細胞產(chǎn)生的IL-8能夠促進巨噬細胞RAW264.7遷徙、侵襲和增長，同時誘導巨噬細胞向M2型轉化進而促進腫瘤細胞發(fā)展。

吉西他濱對M1型巨噬細胞的功能及作用機制尚未見報道。本研究聯(lián)合IFN-γ和LPS將Ana-1巨噬細胞誘導分化為M1型巨噬細胞，考察吉西他濱對其功能的影響。利用巨噬細胞對異物具有很強的吞噬功能的原理，觀察巨噬細胞對熒光納米粒的吞噬，結果發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能夠抑制M1巨噬細胞吞噬功能。炎癥狀態(tài)下，巨噬細胞應激產(chǎn)生自由基ROS和NO，幫助機體清除病原微生物和腫瘤細胞。吉西他濱顯著降低了M1巨噬細胞ROS和NO表達水平。活化的巨噬細胞MHC-Ⅱ表達會上調，同時釋放多種細胞因子，如IL-6和TNF-α。IL-6可參與調節(jié)免疫應答，而TNF-α參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。流式細胞術和ELISA實驗結果表明，吉西他濱抑制了M1巨噬細胞TNF-α和IL-6的釋放并降低了MHC-Ⅱ的表達。以上結果表明吉西他濱能夠抑制M1巨噬細胞功能。

自噬在調節(jié)機體免疫中發(fā)揮了重要作用[14]。本研究考察了吉西他濱對巨噬細胞自噬的影響。發(fā)現(xiàn)IFN-γ和LPS激活的M1巨噬細胞自噬體及相關蛋白LC3-Ⅱ表達顯著升高，而聯(lián)合吉西他濱處理組的M1巨噬細胞自噬體顯著降低。說明吉西他濱能夠抑制M1巨噬細胞自噬。為了研究自噬在巨噬細胞功能中的作用，分別用自噬誘導劑海藻糖（Tre）和自噬抑制劑3-MA激活和抑制細胞自噬，結果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合自噬誘導劑可逆轉吉西他濱對M1巨噬細胞的免疫抑制。表現(xiàn)為吞噬功能增強，細胞因子TNF-α、IL-6及MHC-Ⅱ表達增加。

本研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱能抑制M1型巨噬細胞免疫功能，同時吉西他濱能夠抑制巨噬細胞自噬。激活自噬，能逆轉吉西他濱對M1型巨噬細胞的免疫抑制。本研究為吉西他濱在臨床的應用提供了新的思路。