■冉 函 1， 趙海兵 1 李 進(jìn) 1 張 劍 1，* 劉永茵 1 劉雨倩 1 劉玉蘭

（1.武漢輕工大學(xué)，湖北省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

棉籽粕(CSM)是棉籽油料加工的主要副產(chǎn)物之一，粗蛋白含量豐富，可以作為畜禽飼料蛋白源[1-3]。然而，由于游離棉酚的存在，其應(yīng)用受限[4-5]。游離棉酚（FG），一種多酚聯(lián)萘二醛的黃色化合物，廣泛分布于整個(gè)棉植株的色素腺體中[6]。畜禽攝入FG后，生長(zhǎng)和生育能力受到抑制[7-8]。在研究棉酚對(duì)虹鱒魚(yú)毒性的試驗(yàn)中，含95 mg/kg FG的日糧會(huì)引起虹鱒魚(yú)肝臟和腎臟的組織學(xué)變化；當(dāng)FG增至290 mg/kg，虹鱒魚(yú)的生長(zhǎng)受到抑制；繼續(xù)將FG含量增至531 mg/kg，虹鱒魚(yú)的體重下降，血細(xì)胞比容、血紅蛋白和血漿蛋白明顯減少[9]。由于含量低至100 mg/kg FG也能引起小牛中毒，所以，棉籽粕也不能用作小牛日糧的蛋白補(bǔ)充劑[10]。為了預(yù)防含有棉籽蛋白的配合飼料影響動(dòng)物的生長(zhǎng)與發(fā)育，2001年我國(guó)出臺(tái)了飼料的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，明確規(guī)定了配合飼料中FG含量的安全限量。例如，對(duì)于肉用仔雞和生長(zhǎng)雞、產(chǎn)蛋雞和生長(zhǎng)育肥豬的飼料，每千克日糧中的FG含量相應(yīng)不超過(guò)100、20 mg和60 mg[11]，其中，肉用仔雞和生長(zhǎng)雞相同，均為100 mg，產(chǎn)蛋雞為20 mg，生長(zhǎng)育肥豬為60 mg。

為了降低飼料的生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提高棉籽蛋白在飼料中的比例，在使用棉粕前，有必要采取某些措施以降低棉籽蛋白中游離棉酚（FG）含量。圍繞這一話題，科技工作者一直在尋找降低物料中游離棉酚殘留的方法。如：溶劑萃取法[12-13]、固態(tài)發(fā)酵法[14-15]、硫酸亞鐵法[16]等。在這些方法中，硫酸亞鐵價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛，且能快速降低FG的含量而備受關(guān)注。2019年，棉籽粕脫毒深加工與利用課題組確認(rèn)了5種棉酚鐵復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。其中，棉酚與Fe2+按1∶2摩爾比配位形成的化合物有2個(gè)，另外3種棉酚鐵化合物分別以1∶1，1∶3，1∶4摩爾比形成[17]。研究圓滿地解釋了非水溶劑中亞鐵離子與FG形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，但是，對(duì)于水溶液中棉酚鐵復(fù)合物的穩(wěn)定性報(bào)道很少，而且，迄今為止國(guó)內(nèi)外尚未建立亞鐵離子的添加量與棉籽粕中游離棉酚殘留的關(guān)系。因此，研究棉籽粕中游離棉酚的殘留與亞鐵離子添加量的關(guān)系，不僅關(guān)系到被飼養(yǎng)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，而且還能對(duì)棉籽蛋白的合理利用提供理論指導(dǎo)。文章研究了硫酸亞鐵水溶液對(duì)棉籽粕中游離棉酚殘留的影響，同時(shí)，還探討了水溶液中棉酚鐵復(fù)合物的穩(wěn)定性，分析了結(jié)合棉酚轉(zhuǎn)化為游離棉酚的條件。該研究成果對(duì)棉籽粕的合理利用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

棉籽粕（網(wǎng)絡(luò)購(gòu)得，經(jīng)研磨機(jī)粉碎后收集，過(guò)60目篩的物料篩，混勻，備用。經(jīng)間苯三酚法分析后，該棉籽粕中的FG含量為1 156 mg/kg）；醋酸棉酚(GAA)為Sigma試劑；其他試劑（苯胺、間苯三酚二水合物等）均為國(guó)產(chǎn)分析純。7200型分光光度計(jì)（UNIC公司），pHS-3C型數(shù)字pH儀（上海INESA科學(xué)儀器有限公司），數(shù)顯水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 含硫酸亞鐵的緩沖液制備

準(zhǔn)確稱取一定量的七水硫酸亞鐵固體，溶于相應(yīng)的緩沖溶液中，通過(guò)逐滴滴加鹽酸或氫氧化鈉將溶液酸度調(diào)至給定的pH值，定容。pH值為0.3、0.5、1.0和1.5的硫酸亞鐵溶液用0.2 mol/L的三氯乙酸-三氯乙酸鈉緩沖液配制；pH值為2.0，2.5，3.0，3.5的硫酸亞鐵溶液以0.2 mol/L的氯乙酸-氯乙酸鈉緩沖液配制；pH值為4.0、4.5、5.0、5.5的硫酸亞鐵用0.2 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制。

在試驗(yàn)中，準(zhǔn)確稱取棉籽粕500.0 mg(精確至0.1 mg)，加入2.0 mL含硫酸亞鐵的緩沖液，混勻。于一定溫度條件下水浴反應(yīng)一段時(shí)間后，測(cè)定棉籽粕中游離棉酚的殘留。對(duì)于亞鐵離子添加量與棉籽粕中游離棉酚的摩爾比對(duì)游離棉酚殘留的影響試驗(yàn)，反應(yīng)酸度控制在pH 3.5，反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為25℃、2 h。在酸度、溫度和反應(yīng)時(shí)間的試驗(yàn)中，通過(guò)控制其他變量不變，改變一個(gè)單因素開(kāi)展試驗(yàn)。

1.2.2 棉籽粕中游離棉酚含量的測(cè)定

苯胺法是國(guó)內(nèi)外官方規(guī)定測(cè)定含棉籽粕干燥樣品中游離棉酚含量的方法。該法對(duì)游離棉酚定量的原理如下：游離棉酚與苯胺定量反應(yīng)生成一種二苯胺棉酚的衍生物。該化合物的顯色反應(yīng)需在沸水浴中熱處理30 min[18]。然而，經(jīng)過(guò)我們深入細(xì)致的研究后發(fā)現(xiàn)，該方法并不適用于硫酸亞鐵處理過(guò)的棉籽粕中的FG準(zhǔn)確定量。因?yàn)榉兴〉臒崽幚?，?huì)將亞鐵離子快速氧化為紅色化合物，進(jìn)而干擾二苯胺棉酚衍生物的比色測(cè)定。此外，在強(qiáng)酸性環(huán)境下苯胺與氫離子結(jié)合成苯胺鹽，使二苯胺棉酚衍生物的形成受到抑制。因此，苯胺法也不適用于強(qiáng)酸性環(huán)境下對(duì)棉籽粕中的游離棉酚準(zhǔn)確定量。

干燥棉籽粕中的FG定量也常采用間苯三酚法[19]。其原理為：在高酸性的HCl介質(zhì)中，F(xiàn)G與間苯三酚試劑定量反應(yīng)，生成的有色物質(zhì)在550 nm處有最大吸收，顏色深淺與FG含量呈正比，據(jù)此定量[20]。研究表明，該法反應(yīng)條件溫和，分析樣品勿需高溫?zé)崽幚恚軡M足對(duì)硫酸亞鐵處理過(guò)的棉籽粕中游離棉酚的定量要求。

準(zhǔn)確稱取棉籽粕500 mg（精確至0.1 mg），加入2.0 mL含硫酸亞鐵的緩沖液，混勻。于一定溫度（如：25、30、35、40、45、50、55、60℃）水浴反應(yīng)0.5～3 h，測(cè)定棉籽粕中F G殘留。在研究亞鐵離子添加量與棉籽粕中游離棉酚的摩爾比對(duì)游離棉酚殘留的影響試驗(yàn)中，將酸度、溫度和反應(yīng)時(shí)間分別控制在pH值3.5、25℃和2 h；在酸度試驗(yàn)中，反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為25℃、2 h；在溫度試驗(yàn)中，酸度和時(shí)間分別控制在pH值3.5、2 h；在考慮時(shí)間的影響試驗(yàn)中，分別將酸度和溫度控制在pH值3.5、25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞鐵離子與棉籽粕內(nèi)游離棉酚的摩爾比

亞鐵離子添加量與棉籽粕中游離棉酚的摩爾比，是影響棉籽粕中游離棉酚殘留量的最重要因素之一。保持其他反應(yīng)條件（反應(yīng)酸度、溫度和時(shí)間分別為pH 3.5、25℃、2 h）不變，試驗(yàn)了亞鐵離子的添加量對(duì)棉籽粕中游離棉酚殘留的影響（見(jiàn)圖1）。游離棉酚的殘留量隨硫酸亞鐵濃度的增加而逐漸減少，這是由于硫酸亞鐵與棉酚反應(yīng)形成不溶于水的棉酚鐵復(fù)合物的緣故。當(dāng)亞鐵離子與游離棉酚的摩爾比為5∶1時(shí)，棉籽粕中游離棉酚的殘留為854 mg/kg。進(jìn)一步地將摩爾比提高至10、20、40、50、70、80倍，棉籽粕中的游離棉酚殘留量相應(yīng)從1 156 mg/kg降至629、440、333、222、146 mg/kg和66 mg/kg。考慮到棉籽粕中的其他有機(jī)成分(如植酸、單寧、蛋白質(zhì)等)也能與亞鐵離子結(jié)合，硫酸亞鐵的實(shí)際添加量要遠(yuǎn)高于理論值。動(dòng)物試驗(yàn)表明，用硫酸亞鐵晶體處理棉籽粕，按4∶1的亞鐵離子對(duì)游離棉酚的重量比加料，能抑制蛋黃變色[21]。該劑量相當(dāng)于亞鐵離子對(duì)游離棉酚的摩爾比為37∶1加料，所對(duì)應(yīng)的棉籽粕中游離棉酚含量為400 mg/kg以下。因此，在生產(chǎn)含棉籽蛋白的合成飼料時(shí)，既要考慮被飼養(yǎng)的動(dòng)物對(duì)游離棉酚忍受性的差異，也要兼顧飼料的適口性，以及被飼養(yǎng)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能等因素，將硫酸亞鐵的添加量控制在一個(gè)合理范圍。

圖1 Fe2+與FG摩爾比對(duì)FG殘留的影響

2.2 酸度

酸度是影響棉籽粕中游離棉酚殘留的最主要因素。酸度直接關(guān)系到結(jié)合棉酚的穩(wěn)定性以及棉酚鐵復(fù)合物的形成。酸度對(duì)棉籽粕中游離棉酚殘留的影響見(jiàn)圖2。當(dāng)pH≤2.0時(shí)，棉籽粕或者經(jīng)亞鐵鹽處理過(guò)的棉籽粕中游離棉酚的殘留量隨反應(yīng)初始酸度的增加而迅速增加，這是由于部分結(jié)合棉酚轉(zhuǎn)化為游離棉酚的緣故，該結(jié)果與之前的報(bào)道一致[22]。在酸性條件下棉酚-蛋白可降解為游離棉酚和蛋白。由此可以預(yù)見(jiàn)，當(dāng)含有棉籽粕的飼料通過(guò)單胃動(dòng)物的胃時(shí)，極少量的結(jié)合棉酚在胃酸（pH值1.8）的作用下轉(zhuǎn)化為游離棉酚，進(jìn)而使生物體內(nèi)的游離棉酚含量略有提高。此外，由于亞鐵離子與游離棉酚結(jié)合要釋放出氫離子，導(dǎo)致棉酚鐵復(fù)合物的形成受到抑制。這與Zhang等[17]研究的棉酚鐵復(fù)合物的形成需要釋放氫離子的結(jié)果相符。因此，高酸性環(huán)境對(duì)降低棉籽粕中的游離棉酚殘留不利。當(dāng)pH≥2.0時(shí)，未經(jīng)亞鐵鹽處理的棉籽粕，其游離棉酚殘留受酸度的變化影響小，這表明：在pH值≥2.0時(shí)結(jié)合棉酚的穩(wěn)定性好，難以分解成游離棉酚。然而，酸度的變化對(duì)經(jīng)硫酸亞鐵處理后的物料中的游離棉酚殘留影響較大。在2≤pH值≤3.5的范圍內(nèi)，棉籽粕中的游離棉酚呈下降趨勢(shì)，且在pH值3.5時(shí)降至最低，這是由于該酸性環(huán)境是硫酸亞鐵在水溶液中存在的最穩(wěn)定形式。當(dāng)物料的pH值=4.0時(shí)，游離棉酚殘留量較pH值3.5時(shí)有所反彈。此后，隨著物料酸度降低，棉籽粕中的游離棉酚殘留逐漸下降。這是由于低酸度環(huán)境能促進(jìn)游離棉酚分子中的酚羥基解離，利于棉酚鐵復(fù)合物形成?？傮w來(lái)講，在給定的酸度下，經(jīng)硫酸亞鐵處理過(guò)的棉籽粕物料中的游離棉酚殘留要比對(duì)照低，而且，隨著亞鐵鹽補(bǔ)充量增大，游離棉酚的殘留也越低。

圖2 酸度對(duì)FG殘留的影響

2.3 反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間是降低棉籽粕中游離棉酚殘留的另一關(guān)鍵因素。反應(yīng)時(shí)間對(duì)游離棉酚殘留的影響見(jiàn)圖3。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間介于0.5～2.0 h時(shí)，游離棉酚的殘留量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，在2 h時(shí)降至最低。繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，對(duì)棉籽粕中游離棉酚殘留的降低貢獻(xiàn)不大。可見(jiàn)，較短的作用時(shí)間，導(dǎo)致亞鐵離子和游離棉酚之間的化學(xué)反應(yīng)不充分，出現(xiàn)高殘留的游離棉酚現(xiàn)象。2 h后，棉酚鐵復(fù)合物的形成達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為2 h較為合理。

圖3 時(shí)間對(duì)棉籽粕中FG殘留的影響

2.4 反應(yīng)溫度

溫度是影響化學(xué)反應(yīng)速率的一個(gè)重要因素。溫度對(duì)物料中的游離棉酚殘留的影響見(jiàn)圖4。由圖4不難得出，低溫利于減少棉籽粕中游離棉酚的殘留量，這說(shuō)明棉酚鐵復(fù)合物的形成是一個(gè)放熱過(guò)程。在實(shí)際脫毒過(guò)程中，一般選用常溫條件下操作，即將一定量的七水硫酸亞鐵晶體添加至棉粕中，充分混勻。在飼養(yǎng)動(dòng)物前1～2 h，補(bǔ)加適當(dāng)?shù)乃?，調(diào)和完畢后，再供動(dòng)物飼用。

圖4 溫度對(duì)棉籽粕中FG殘留的影響

3 結(jié)論

向棉籽粕中補(bǔ)充硫酸亞鐵，利于減少游離棉酚的殘留。棉酚鐵復(fù)合物的形成為放熱過(guò)程，2 h的反應(yīng)能形成穩(wěn)定的棉酚鐵復(fù)合物。另外，高酸性環(huán)境能抑制棉酚鐵復(fù)合物的形成，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致部分結(jié)合棉酚轉(zhuǎn)化為游離棉酚。