■陳天賜 李 玲 王小翠 郭 慧

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點實驗室，廣東湛江 524088）

近年來，代謝組學技術(shù)在水產(chǎn)動物病理學、生理學、毒理學及水產(chǎn)品質(zhì)量檢測等方面都有應(yīng)用[1-3]。在毒理學的研究中，傳統(tǒng)的毒性測試實驗具有通量低、周期長、敏感度低等不利因素[4]，隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)毒性脅迫時生物體內(nèi)的內(nèi)源性小分子代謝物也會發(fā)生顯著的變化[1]，代謝組學這種快速、高效的檢測技術(shù)逐漸在毒理學研究中得到廣泛應(yīng)用。代謝組學應(yīng)用于毒理學技術(shù)研究的基本原理是當毒性物質(zhì)脅迫生物體時，造成生物體內(nèi)代謝途徑中內(nèi)源性代謝物的變化，代謝組學的檢測技術(shù)能對生物體受到脅迫之后的細胞、組織或者整個生物體的各種代謝通路中涉及的化合物進行定性定量分析，可以很好地證明生物體在受到毒性脅迫后細胞、組織或生物體受到的損害[4]。與基因組學不同對的是，代謝組學可以證明毒性物質(zhì)對生物體造成的最終影響，而且在不同的生物體中，基因的結(jié)構(gòu)和功能可能各不相同，但是代謝物在不同物種間結(jié)構(gòu)與功能是高度保守的[5]，例如丙酮酸、乳酸這些代謝物，無論是在人類、老鼠、植物中其結(jié)構(gòu)與功能都是一樣的，這也意味著代謝組學中相同的分析與計算工具可以適用于任何物種[6]。此外，代謝組學技術(shù)得到的信息不一定與我們試驗假設(shè)的結(jié)果有因果關(guān)系，可能是其他因素影響的結(jié)果，這也有利于我們從中發(fā)掘到一些新的信息[5]。

1 代謝組學分析技術(shù)

代謝組學常用的分析技術(shù)包括核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatog?raphy-mass spectrometry，GC-MS）三種[7]。Bloch等[8]和Purcell等[9]發(fā)現(xiàn)，當具有奇數(shù)核子（包括質(zhì)子和中子）的原子核置于磁場中，在外加特定頻率的射頻場時，會產(chǎn)生原子核吸收射頻場能量的現(xiàn)象，這就是核磁共振現(xiàn)象[10]，核磁共振吸收的大小不僅與原子核本身有關(guān)，而且與所受的磁場強度有關(guān)[11]。其中氫譜（1H-NMR）是目前廣泛應(yīng)用的核磁共振檢測技術(shù)[2]；1985年北京分析測試學術(shù)報告會暨展覽會國際會議上首次展出GC-MS聯(lián)用儀，此后，各種聯(lián)用技術(shù)在對復雜化學物質(zhì)分析過程中不斷發(fā)展[12]，其中色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（主要是LC-MS與GC-MS技術(shù)）結(jié)合了色譜高分離和質(zhì)譜高鑒別性能的優(yōu)點，在生命科學和醫(yī)藥研究的各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[13]。

2 代謝組學在水產(chǎn)動物毒理學研究中的應(yīng)用

代謝組學在水產(chǎn)動物研究中的應(yīng)用主要是通過分析水產(chǎn)動物受毒性物質(zhì)脅迫后組織、細胞或生物體中的代謝物隨時間的變化，確定毒性作用的靶器官和組織、毒性作用的過程和生物標志物，以進行毒性物質(zhì)作用機制研究或毒性評價[14]。

2.1 代謝組學在水產(chǎn)動物重金屬毒性研究中的應(yīng)用

甲殼類動物是漁業(yè)資源重要組成部分，是淺近海捕撈和養(yǎng)殖的重要對象。Ji等[15]對重金屬污染海域下的脊腹褐蝦（Crangon affifinis）進行研究。1H-NMR分析表明，黃河入?？诤Ｓ蚣垢购治r丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺含量上升，可能與脊腹褐蝦的滲透調(diào)節(jié)相關(guān)，丙二酸、磷酸膽堿、AMP含量的變化可能與脊腹褐蝦能量代謝相關(guān)。萊州灣海域脊腹褐蝦氨基酸和其他滲透壓相關(guān)有機物的變化則證明重金屬污染對脊腹褐蝦滲壓調(diào)節(jié)的影響，ATP、AMP含量升高，葡萄糖含量的顯著降低，表明金屬污染引起能量消耗的增強，而乳酸含量的減少證明無氧呼吸的減弱，此外，也發(fā)現(xiàn)丙氨酸和精氨酸可以作為重金屬鎘(Cd)污染的生物標記物，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和酪氨酸可以作為重金屬砷(As)污染的生物標記物。Yu等[16]基于1HNMR的代謝組學對渤海金屬污染海域的三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）進行研究，其中三個位點三疣梭子蟹Cd含量均超過了海洋生物質(zhì)量標準一級，S3562位點Cu含量超過了海洋生物質(zhì)量標準二級。代謝組學分析結(jié)果顯示三個位點中三疣梭子蟹支鏈氨基酸含量均處于較低水平，支鏈氨基酸在免疫細胞蛋白質(zhì)合成中起重要作用，因此，高濃度的Cd可能誘導了三疣梭子蟹的免疫響應(yīng)。S6151位點磷酸膽堿、丙二酸含量升高，乙酰乙酸含量下降，證明金屬污染影響三疣梭子蟹三羧酸循環(huán)和脂質(zhì)代謝。S6351位點ATP含量顯著上升，2-羥基戊二酸含量下降，可能是2-羥基戊二酸脫氫酶活性下降造成對ATP合成酶的抑制減弱，導致ATP含量的升高和糖原減少，此外，肌苷含量減少可能造成肌肉運動的減緩。S3562位點牛磺酸、甘氨酸、龍蝦膽堿含量顯著升高，但是酪氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等含量顯著的下降，可能是金屬脅迫下三疣梭子蟹通過降低氨基酸含量調(diào)節(jié)滲透平衡。Ding等[17]用GC-MS代謝組學研究慢性Pb暴露對日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）幼蝦的影響，發(fā)現(xiàn)氧代脯氨酸和賴氨酸含量較高，?；撬帷ⅧB氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量較低，有相關(guān)研究認為?；撬崤c抗氧化和線粒體代謝調(diào)控相關(guān)，而且Pb的毒性機制之一是氧化脅迫，因此，?；撬峤档捅砻鱌b脅迫引起了氧化應(yīng)激反應(yīng)。甘氨酸是發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，鳥氨酸是大腦中最豐富的氨基酸，因此，Pb脅迫也可能會造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

魚類是最古老的脊椎動物，存在于地球上大部分的水生環(huán)境中，因此水體污染極可能對水體中魚類動物的健康造成影響。Cappello等[18]用以1H-NMR代謝組學方法研究Hg對金鮻（Liza aurata）鰓的毒性作用，代謝組學分析顯示肌酸、乳酸、丙氨酸濃度上升，甘油磷酸膽堿、還原性谷胱甘肽含量下降。鰓中肌酸含量的上升可能是生成更多Na+/K+-ATP以維持滲透壓的平衡，乳酸含量的上升證明在Hg脅迫下機體通過無氧呼吸產(chǎn)生更多的能量以維持機體正常代謝，丙氨酸可以將游離氨攜帶到肝臟中，丙氨酸含量上升可能是為了減少毒性脅迫下蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的大量游離氨基酸，甘油磷酸膽堿的顯著下降可能與細胞膜修復相關(guān)，還原性谷胱甘肽減少可能是作為抗氧化劑應(yīng)對Hg脅迫。Khan等[19]基于1H-NMR技術(shù)研究了Pb和Cd毒性作用下銀鯽（Carassius auratus gibelio）的血液代謝譜，Pb暴露的銀鯽血液丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸顯著下降，Cd暴露后，賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸含量顯著下降，3-羥基丁酸、丙酮、乳酸、膽堿、肌苷、鳥苷和蘇氨酸含量增加，Pb和Cd共暴露時丙酮酸、鳥苷和肌苷含量的增加比單一毒性物質(zhì)暴露時更加顯著，結(jié)果證明Pb暴露影響銀鯽的神經(jīng)傳導與氨基酸代謝，此外，Pb或Cd暴露均能干擾能量代謝和滲透調(diào)節(jié)，Pb和Cd共暴露時對能量代謝的影響更加顯著。Steven等[20]運用非靶向NMR技術(shù)研究了雨季與旱季兩個不同區(qū)域（正常水體和金屬Sb污染水體）食蚊魚（Gambusia holbrooki）的代謝物質(zhì)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同時間地點采集的樣品代謝物種類相似，但是在旱季采集的樣品，金屬污染組代謝物的數(shù)量具有顯著的差異，金屬污染組大多數(shù)代謝物的含量上升，少數(shù)幾種與金屬結(jié)合、排泄、解毒等功能相關(guān)代謝物含量顯著下降，其中天冬氨酸、組氨酸、肌醇、?；撬岷湍憠A含量可以作為金屬毒性的生物標記物。

軟體動物因分布廣泛、易收集和對帶毒物質(zhì)耐受性強等特點常常用做環(huán)境檢測生物。Wu等[21]研究菲律賓蛤（Venerupis philippinarum）對金屬污染的生物監(jiān)測作用，測試了兩個家系的蛤?qū)Ｑ蠼饘貱d和Zn毒理學效應(yīng)，結(jié)果表明，在Cd或Zn脅迫下兩種蛤的代謝物之間具有顯著的差異，例如在Cd脅迫的白蛤中發(fā)現(xiàn)了支鏈氨基酸、脯氨酸和糖原增加，谷氨酸減少，而在斑馬蛤中卻發(fā)現(xiàn)了谷氨酰胺增加，精氨酸、乙酰乙酸和天冬氨酸減少。此外，在Zn脅迫下兩種蛤滲透調(diào)節(jié)相關(guān)代謝物（例如：牛磺酸、亞?；撬?、龍蝦膽堿）的變化也具有顯著的差異。這表明兩種蛤?qū)饘倜{迫具有不同的響應(yīng)機制。Zhang等[22]利用1H-NMR代謝組學技術(shù)研究Cu對菲律賓簾蛤（Ruditapes philippi?narum）的毒性影響，結(jié)果顯示與滲透壓調(diào)節(jié)、檸檬酸循環(huán)相關(guān)的代謝物質(zhì)發(fā)生顯著的變化，例如龍蝦膽堿、支鏈氨基酸的增加，琥珀酸、丙氨酸和二甲胺含量減少，因此，Cu脅迫可能干擾菲律賓簾蛤滲透調(diào)節(jié)和能量代謝。Wu等[23]運用蛋白質(zhì)組學和代謝組學方法對不同鹽度下As對菲律賓蛤（Ruditapes philippinarum）鰓的毒性作用進行研究，發(fā)現(xiàn)正常鹽度（31.1 psu）下As脅迫造成琥珀酸鹽和延胡索酸鹽水平上升，可能與鰓的能量代謝相關(guān)，中低鹽度（23.3 psu和15.6 psu）下甜菜堿濃度明顯的上升，可能是As脅迫造成對菲律賓蛤鰓的滲透壓的影響，低鹽度（15.6 psu）下As脅迫造成ATP和甜菜堿含量顯著上升，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和酪氨酸含量下降，可能與細胞能量代謝相關(guān)。蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析顯示ATP合成酶上調(diào)及琥珀酰-CoA合成酶和核苷二磷酸激酶的下調(diào)，表明As影響菲律賓蛤的能量代謝。代謝組學和蛋白質(zhì)組學聯(lián)合分析進一步證實As脅迫影響菲律賓蛤鰓的能量代謝。Yu等[24]運用NMR代謝組學與蛋白質(zhì)組學研究了亞砷酸鹽As（Ⅲ）和砷酸鹽As（Ⅴ）對貽貝（Mytilus galloprovincialis）的毒理學效應(yīng)，代謝組學分析表明As（Ⅲ）和As（Ⅴ）脅迫引起多類代謝物發(fā)生顯著改變，包括氨基酸、有機滲透物質(zhì)、能量儲存物質(zhì)，結(jié)果表明As（Ⅲ）和As（Ⅴ）可干擾貽貝滲透調(diào)節(jié)以及免疫應(yīng)激，As（Ⅴ）造成能量代謝的紊亂。蛋白質(zhì)組學與代謝組學聯(lián)合分析進一步證明了As（Ⅴ）脅迫下可以造成貽貝能量代謝的紊亂。

2.2 代謝組學在水產(chǎn)動物其他毒性物質(zhì)研究中的應(yīng)用

除重金屬外，代謝組學技術(shù)也應(yīng)用到水體其他有毒有害物質(zhì)研究中（如表1）。例如有機農(nóng)藥、氨氮、抗生素等，代謝組學的分析結(jié)果顯示，這些水體污染物均在不同程度的影響水產(chǎn)動物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的差異變化，透過差異代謝物的變化揭示了水體中毒性物質(zhì)的毒性機制，例如引起水產(chǎn)動物體內(nèi)免疫、抗氧化、滲透調(diào)節(jié)、能量代謝、細胞損傷等變化，進而影響其健康生長甚至導致水產(chǎn)動物的死亡。

表1 近年關(guān)于代謝組學應(yīng)用于水產(chǎn)動物毒理學研究的報道

表1（續(xù)）近年關(guān)于代謝組學應(yīng)用于水產(chǎn)動物毒理學研究的報道

3 不足與展望

目前代謝組學技術(shù)在水產(chǎn)動物毒理學研究中應(yīng)用廣泛，但還存在著一些不足：①代謝組學要求對代謝組中所有代謝物進行分析，但是，目前沒有任何一種技術(shù)能對生物體內(nèi)所有的代謝物進行檢測[49]；②代謝組學可以得到大量的信息，但是，缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，信息處理較為繁雜，因此，對這些信息處理的技術(shù)還是需要不斷地提高才能更好地研究代謝產(chǎn)物的變化是表征的生理或病理的變化[7]；③不同年齡階段、遺傳變異、動物品系的代謝產(chǎn)物具有明顯的差異，這導致如何判斷生物體是發(fā)生了病理的變化還是生理的變化成為一個難題[50]；④當機體的生理和藥理效應(yīng)超敏時受試物即使沒有相關(guān)毒性，也可能引起明顯的代謝變化，導致假陽性結(jié)果[51]；⑤靈敏度和動態(tài)檢測范圍方面具有一定的局限性，檢測的靈敏度受到檢測樣品量的影響[7]。但是，代謝組學技術(shù)快速、高效的特點是傳統(tǒng)毒理學檢測手段所不能比擬的，隨著代謝組學技術(shù)的不斷發(fā)展，在水產(chǎn)動物毒理學研究中的應(yīng)用不斷成熟，代謝組學技術(shù)必定會為促進水產(chǎn)動物毒理學研究做出重大貢獻。