陳祥義, 于得臣, 張芮浩, 胡一村, 王克平, 2, 周海宇, 2

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 骨科, 甘肅 蘭州, 730030; 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院西固醫(yī)院 骨科, 甘肅 蘭州, 730030)

促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶(Eph)受體及其配體(Ephrin)屬于最大的受體酪氨酸激酶(RTKs)家族，其在生物體內(nèi)的功能十分復(fù)雜。Eph因在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中表達(dá)產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素而命名，是受體酪氨酸激酶的一個亞家族，在許多類型的細(xì)胞信號傳遞中起著重要作用。1987年, Hirai首次發(fā)現(xiàn)并證明Eph基因表達(dá)的產(chǎn)物是一種跨膜蛋白，當(dāng)時認(rèn)為其是生長因子的受體，并推測其在腫瘤致病過程中發(fā)揮作用。經(jīng)過不斷的深入研究, Eph/Ephrin參與癌癥發(fā)生和發(fā)展的作用得到證實[1]。此外, Eph/Ephrin還通過雙向信號參與細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞間連接、細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動，影響神經(jīng)元的發(fā)育和骨骼穩(wěn)態(tài)等，是血管生成和淋巴管生成的關(guān)鍵因素。Eph/Ephrin在成骨、破骨細(xì)胞信號傳導(dǎo)和維持骨平衡、骨折愈合等方面也發(fā)揮作用，如EphB4/EphrinB2反向信號抑制破骨細(xì)胞分化，正向信號增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化，通過該雙向信號傳導(dǎo)參與骨穩(wěn)態(tài)平衡和骨重建[2]。本研究主要討論了Eph/Ephrin在原發(fā)性骨腫瘤及轉(zhuǎn)移性骨腫瘤導(dǎo)致的骨癌疼痛(BCP)中的作用機(jī)制，為骨腫瘤和BCP臨床靶向藥物的研究提供新思路。

1 Eph/Ephrin家族組成及結(jié)構(gòu)

Eph和Ephrin依據(jù)結(jié)構(gòu)不同都可以分為A、B兩個家族, Eph包括EphA(EphA1-8, EphA10)、EphB(EphB1-5), Ephrin包括EphrinA(EphrinA1-5)、EphrinB(EphrinB1-5)。Eph與其他大多數(shù)類型的RTKs一樣屬于跨膜蛋白，其中胞外區(qū)屬于配體結(jié)合區(qū)，其包含配體結(jié)合域、富含半胱氨酸的區(qū)域和2個富含纖維蛋白Ⅲ的區(qū)域; 胞內(nèi)區(qū)是功能區(qū)，包括近膜區(qū)(含2個酪氨酸殘基)、經(jīng)典蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、不育α基序(SAM)和包含疏水殘基的突觸后致密蛋白(PDZ)結(jié)構(gòu)域。Ephrin的2種類型結(jié)構(gòu)不一樣, EphrinA通過糖脂磷脂酰肌醇(GPI)連接到細(xì)胞表面, EphrinB通過跨膜結(jié)構(gòu)域連接到細(xì)胞表面，EphrinB的胞內(nèi)功能區(qū)有高度保守的區(qū)域和PDZ結(jié)構(gòu)域[3]。這些結(jié)構(gòu)序列控制和調(diào)節(jié)不同受體和配體之間的結(jié)合，以引起不同的生理和病理反應(yīng)。Eph/Ephrin的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 Eph/Ephrin結(jié)構(gòu)圖

Eph/Ephrin信號傳導(dǎo)模式多樣。Ephrin能與細(xì)胞膜上的非Eph受體結(jié)合，例如Ephrin-B2介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子受體和血小板衍生生長因子受體家族成員的內(nèi)吞作用，從而參與腫瘤血管的生成和傷口修復(fù)[4-5]。Eph和Ephrin可進(jìn)行雙向信號傳導(dǎo)。Eph與聚集的、膜附著的Ephrin結(jié)合時被激活，然后通過與銜接蛋白偶聯(lián)將信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，通過自身磷酸化和酪氨酸殘基的磷酸化實現(xiàn)整個信號傳導(dǎo)[6]。Eph通過 SAM和C-末端PDZ結(jié)構(gòu)域與其他蛋白結(jié)合傳導(dǎo)信號。EphrinA通過GPI與跨膜部分相互作用，而EphrinB的信號傳導(dǎo)分為磷酸化依賴性和非磷酸化依賴性。EphrinB的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸化導(dǎo)致信號分子募集從而傳導(dǎo)信號，而未磷酸化的EphrinB與信號蛋白結(jié)合傳導(dǎo)信號，且受酪氨酸磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)[7]。鄰近細(xì)胞之間的Eph和Ephrin結(jié)合產(chǎn)生細(xì)胞依賴的雙向信號，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、運(yùn)動、存活和增殖[8-9]。EphA和EphB受體之間也能結(jié)合并交叉磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[10]。Eph受體激活的程度及信號類型取決于配體的聚集狀態(tài)。Eph與Ephrin相互作用形成Eph/Ephrin四聚體，促進(jìn)高階低聚物的組裝，這是Eph磷酸化和下游信號激活的前提[11]。研究[12]表明，Eph信號能參與包括黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、卵巢癌、食管癌、肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Eph/Ephrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能通過激活Src、STAT3、MMP8和RAC1等促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲[13]。

2 原發(fā)性骨腫瘤與Eph/Ephrin

2.1 骨髓瘤與Eph/Ephrin

骨髓瘤起源于骨髓造血組織，是因漿細(xì)胞過度增生引起的惡性腫瘤。骨髓瘤易產(chǎn)生多發(fā)性骨損害，又稱多發(fā)性骨髓瘤(MM)，約占血液惡性腫瘤的10%[14]。在MM患者中，約80%的患者存在骨痛、病理性骨折、椎體塌陷和高鈣血癥，此類患者預(yù)后較差[15]。EphrinB2/EphB4信號在成骨和破骨細(xì)胞信號傳遞和功能維持中發(fā)揮重要作用[16]。PENNISI A等[17]發(fā)現(xiàn)MM患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中EphrinB2/EphB4表達(dá)降低。在MM患者的間充質(zhì)干細(xì)胞中, Wnt3a促進(jìn)靶基因EphB4的表達(dá)。EphrinB2-Fc促使EphB4磷酸化，從而抑制MM患者間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用。OSHIMA T等[18]證明骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生Wnt通路抑制劑Frizzled相關(guān)蛋白2, 從而抑制MM患者成骨細(xì)胞的生成和骨形成。因此，骨髓瘤患者中EphB4的下調(diào)可能是因為骨髓瘤Wnt信號通路被抑制所致。PENNISI A等[17]還發(fā)現(xiàn)MM患者的成骨能力受到了損害。

EphB4-Fc治療能抑制骨髓瘤生長、破骨細(xì)胞形成和血管生成，并刺激成骨細(xì)胞生成和骨形成，而EphrinB2-Fc能刺激血管生成、成骨細(xì)胞生成和骨形成，但對破骨細(xì)胞生成和骨髓瘤生長無影響。上調(diào)骨細(xì)胞內(nèi)源性EphB4和EphrinB2的表達(dá)(例如用Wnt3a治療)或者外源性增加EphB4水平(例如用EphB4-Fc處理)可能有助于恢復(fù)骨重塑能力，同時抑制多發(fā)性骨髓瘤的生長、骨病發(fā)生和血管生成。GUAN M等[19]發(fā)現(xiàn)EphA3在MM中高表達(dá)。研究[20]顯示EphA3缺失能抑制MM患者血管內(nèi)皮細(xì)胞(MMECs)體外血管生成，但是缺失EphA3并不影響正常內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的血管生成功能，而且在體外抗EphA3抗體能降低MMECs的血管生成。EphA3還影響MMECs細(xì)胞的黏附，但是對凋亡幾乎無影響[21]。EphA4能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增加Akt的磷酸化(p-AKT)促進(jìn)MM細(xì)胞的增值而抑制其凋亡，還能通過MM細(xì)胞中p-AKT促進(jìn)細(xì)胞黏附、介導(dǎo)其耐藥。雖然目前其參與耐藥的具體機(jī)制還沒有研究清楚，但這可能是MM患者耐藥的一個分子靶點。

2.2 尤文氏肉瘤、軟骨肉瘤與Eph/Ephrin

尤文氏肉瘤(ES)是一種罕見的、高度侵襲性的腫瘤，多見于長骨骨干、骨盆，占兒童腫瘤的3%，是兒童和青少年時期較為常見的骨腫瘤，腫瘤局限患者生存率為70%～80%, 腫瘤患者生存率約為30%[22]。ES雖對放療敏感，但易發(fā)生轉(zhuǎn)移，單純的放療難以對轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)病例產(chǎn)生效果。雖然目前采用的綜合治療方案使ES患者的生存率有所提高，但是腫瘤轉(zhuǎn)移患者的整體預(yù)后較差。血道轉(zhuǎn)移是經(jīng)典的腫瘤轉(zhuǎn)移方式, EphA2在腫瘤血管生成中的作用已被證實[23]。SAINZ-JASPEADO M等[24]探討了EphA2在ES血管生成中的作用及其與小窩蛋白1(CAV1)的關(guān)系，結(jié)果顯示EphA2是ES血管生成的條件, EphA2-CAV1軸能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤遷移，從而有利于ES的血管生成。若能特異性阻斷這種作用，將會延緩腫瘤進(jìn)展，降低腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險，為臨床治療提供一定的幫助。

軟骨肉瘤是一種成軟骨性的惡行腫瘤，約占骨原發(fā)性惡性腫瘤的20%, 通常發(fā)生在骨盆或長骨中，常出現(xiàn)黏液樣變、鈣化和骨化。軟骨肉瘤可以單發(fā)，也可以由內(nèi)生軟骨瘤和骨軟骨瘤惡變而來[25]。KALINSKI T等[26]發(fā)現(xiàn)軟骨肉瘤中EphrinA5下調(diào)，且與軟骨肉瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。因此，EphrinA5在軟骨肉瘤中可能發(fā)揮抑癌基因功能, EphrinA5與細(xì)胞的黏附有關(guān)[27], 推測EphrinA5的下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力上調(diào)是通過細(xì)胞的黏附功能實現(xiàn)的，當(dāng)然這需要進(jìn)一步探索。

2.3 骨肉瘤與Eph/Ephrin

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的一種高度侵襲性骨腫瘤，目前的綜合治療的療效有所提高，但5年生存率依然很低。ABDOU A G等[28]發(fā)現(xiàn)EphrinA4在骨肉瘤細(xì)胞中有2種不同的表達(dá)模式，即胞質(zhì)模式和核質(zhì)模式。EphrinA4在骨肉瘤患者中表達(dá)強(qiáng)于正常和原發(fā)性骨肉瘤患者。核質(zhì)模式在正常骨中占優(yōu)勢，在惡性病例中減少，而在侵襲性轉(zhuǎn)移的惡性病例中，其染色模式都呈現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)模式[28]。胞質(zhì)模式與腫瘤類型、分期和轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性，即病理類型分化越差、分期越晚，發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例中胞質(zhì)模式占比更高。EphrinA4在胞質(zhì)的表達(dá)與原發(fā)性骨肉瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān), 95%的胞質(zhì)模式患者對化療反應(yīng)較差，證明EphrinA4胞質(zhì)染色模式可能是骨肉瘤具有高侵襲性、預(yù)后不良的指標(biāo)[29]。EphrinA4有2種染色模式，可能因位置不同而發(fā)揮不同的功能，在胞質(zhì)中可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性，核質(zhì)型向胞質(zhì)型的轉(zhuǎn)化可能是腫瘤進(jìn)展的一種機(jī)制，但具體通過何種途徑向胞質(zhì)型轉(zhuǎn)化尚未闡明。換言之，靶向阻斷其向胞質(zhì)型模式轉(zhuǎn)化，可能會減緩腫瘤進(jìn)展、降低OS患者化療耐藥。

與健康骨組織相比, EphA2在人類OS腫瘤樣本中上調(diào)，且與患者存活率低有相關(guān)性。研究[30]表明，靶向腺病毒載體可以通過EphA2內(nèi)化到OS細(xì)胞中，與人類初級成骨細(xì)胞相比, OS細(xì)胞的這種攝取率更高。通過EphA2靶向遞送藥物可能是提高OS療效的策略。研究[31]顯示EphrinA1配體結(jié)合EphA2受體可促進(jìn)Ras-MAPK信號通路的激活，而且EphrinA1-EphA2信號增強(qiáng)了骨肉瘤細(xì)胞的遷移。雖然機(jī)制尚不清楚，但是EphrinA1-EphA2既參與上調(diào)Ras-MAPK信號通路的激活，又促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移，相信EphrinA1-EphA2將來可能會成為OS治療的一個靶點。Notch信號具有促進(jìn)骨肉瘤增殖、增強(qiáng)化學(xué)耐藥性、促進(jìn)遷移和侵襲、促進(jìn)原發(fā)性腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移等作用。研究[32]顯示EhrinB1是Notch途徑的作用靶點，激活的Notch信號誘導(dǎo)EphrinB1的表達(dá)，上調(diào)EphrinB1信號可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而且EphrinB1缺失能減輕Notch信號介導(dǎo)的骨肉瘤化療耐藥性。Notch信號介導(dǎo)多種腫瘤的進(jìn)展，目前的研究已經(jīng)證明其在OS中是通過EphrinB1發(fā)揮重要作用的，進(jìn)一步深入研究其中的具體機(jī)制將具有廣闊前景。

3 轉(zhuǎn)移性骨腫瘤所致的BCP與Eph/Ephrin

惡性腫瘤經(jīng)常發(fā)生轉(zhuǎn)移，而骨是腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移器官之一，可以使骨發(fā)生成骨或溶骨性改變。研究[33]統(tǒng)計60%～84%的晚期癌癥患者會經(jīng)歷不同程度的骨痛，當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移時，患者的生存周期將大幅下降，而且常會發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，如病理性骨折、癌癥性骨痛、神經(jīng)壓迫等。目前BCP尚無有效的治療方法，主要還是使用阿片類鎮(zhèn)痛劑，因此急需尋找一種能減輕BCP的方式。在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型中，脊髓中EphrinB1和EphB1表達(dá)顯著增加。小鼠脊髓鞘內(nèi)注射EphB1阻斷劑EphB1-Fc可顯著減輕骨癌引起的機(jī)械性疼痛，而且骨轉(zhuǎn)移模型小鼠相對于正常小鼠的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)上調(diào)，而鞘內(nèi)注射EphB1-Fc后其含量顯著降低[34]。所以, EphB1-Fc鞘內(nèi)注射可能是一種有效減少BCP發(fā)生的方式。YU S N等[35]采用BCP小鼠模型發(fā)現(xiàn)miR-129-5p通過抑制EphB1/EphrinB2信號表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，這可能會是一個有效的治療靶點。

LIU S等[36]發(fā)現(xiàn)BCP與脊髓背角和初級神經(jīng)元中EphB1及EphrinB2的上調(diào)相關(guān)。特異性阻斷EphB1減少了BCP中NR1和NR2B受體、Src的磷酸化，以及隨后各種依賴Ca2+的信號酶、CREB、c-Fos的激活和骨癌疼痛行為的激活。阻斷EphB1后還能解除BCP對嗎啡治療的耐受，故脊髓中EphB1受體信號對骨癌疼痛的發(fā)展和解除癌性疼痛的嗎啡耐受至關(guān)重要。鞘內(nèi)注射EphB1受體阻斷劑EphB2-Fc后，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)性骨破壞有所改善。此外, EphB1受體還通過Toll樣受體激活脊髓中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的IL-1β和 TNF-α參與BCP[37]。因此, EphB1參與BCP的發(fā)生、發(fā)展，而且與嗎啡耐受有關(guān)，并能改善BCP患者骨破壞, Eph/Ephrin在骨腫瘤及BCP中的作用見表1。

表1 Eph/Ephrin在骨腫瘤中的作用

4 小 結(jié)

Eph/Ephrin已經(jīng)成為多種癌癥的調(diào)節(jié)因子，能夠增強(qiáng)或者抑制致癌信號的活性。但是，目前對Eph/Ephrin如何在分子水平上調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展知之甚少。Eph/Ephrin參與腫瘤血管生成、化療耐藥和BCP的發(fā)生過程，可能會成為腫瘤分級及預(yù)后標(biāo)志物，并有望改善腫瘤相關(guān)的骨破壞。特異性的靶向藥物是目前研究的熱點，目前在Eph/Ephrin中也有相關(guān)研究[38], 例如抗EphrinA4-卡奇霉素結(jié)合物能有效靶向作用于三陰性乳腺癌和卵巢腫瘤起始細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤持續(xù)消退。總之，在原發(fā)性或者轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中Eph/Ephrin發(fā)揮了明顯的作用，充分理解其內(nèi)在的分子作用機(jī)制，將有助于闡明骨腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并有助于開發(fā)新的抗癌療法。