李 慧, 曹博雅, 任璐彤, 魏紫櫻, 李佳怡,郭媛媛, 王 葦, 曹俊嶺, 2

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院, 北京, 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 藥學(xué)部, 北京, 100078)

感冒是一種常見的急性上呼吸道病毒性感染性疾病，患者多伴有鼻塞、流涕、咳嗽、噴嚏、頭痛、發(fā)熱等，病情多呈自限性[1]。從中醫(yī)角度講，感冒分為風(fēng)寒感冒與風(fēng)熱感冒，其中風(fēng)寒感冒是由外感風(fēng)寒之邪所致，又稱傷風(fēng)感冒，秋、冬兩季高發(fā)，伴有低熱、頭痛、四肢酸痛、鼻塞流涕、咳嗽咳痰等主要癥狀[2]。治傷風(fēng)顆粒以《傷寒論》中經(jīng)典名方“葛根湯”為基礎(chǔ)方，配伍人參并加入對(duì)乙酰氨基酚、無水咖啡因、鹽酸那可汀和馬來酸氯苯那敏等西藥成分，可用于治療傷風(fēng)頭痛、感冒發(fā)燒、支氣管炎、鼻塞、神經(jīng)痛等病癥[2]。陳麗等[3]研究結(jié)果顯示，治傷風(fēng)顆粒可有效緩解因外感引起咽喉不適患者的臨床癥狀。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討治傷風(fēng)顆粒治療普通風(fēng)寒感冒的活性成分及作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，探討其潛在的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 研究平臺(tái)、軟件與方法

1.1 研究平臺(tái)及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php/); 藥物靶點(diǎn)信息數(shù)據(jù)庫(kù)(DrugBank, https://www.drugbank.ca/); 人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards, https://www.genecards.org/); 功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(STRING, https://string-db.org/)。R軟件(https://www.r-project.org/, 版本4.0.3); Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/, 版本3.7.1); Perl軟件(https://www.perl.org/, 版本5.32.0)。

1.2 治傷風(fēng)顆粒藥物靶點(diǎn)篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，關(guān)鍵詞為“葛根”“麻黃”“桂枝”“白芍”“大棗”“生姜”“甘草”“人參”，主要檢索治傷風(fēng)顆粒中的中藥化學(xué)成分，并以生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)活性成分進(jìn)行初步篩選。應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索復(fù)方中各成分的藥物靶點(diǎn)信息，并將篩選出的蛋白靶點(diǎn)應(yīng)用R軟件轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。

1.3 感冒相關(guān)靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)的篩選

以"cold"為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選疾病靶點(diǎn)，獲得感冒相關(guān)靶點(diǎn)信息。將疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，提取出兩者的共同靶點(diǎn)，作為治傷風(fēng)顆粒治療感冒的潛在作用靶點(diǎn)，利用R軟件繪制兩者交集的韋恩圖。

1.4 治傷風(fēng)顆粒復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將治傷風(fēng)顆?；钚猿煞旨敖患悬c(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件，構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，即“治傷風(fēng)顆?；钚猿煞?作用靶點(diǎn)-感冒”的可視化交互網(wǎng)絡(luò)。

1.5 治傷風(fēng)顆粒治療感冒的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種來源為"Homo sapiens", 設(shè)置"minimum required interaction score"為0.700, 去除游離蛋白靶點(diǎn)，建立PPI并得出治傷風(fēng)顆粒治療感冒作用靶點(diǎn)頻次。

1.6 GO分析和KEGG分析

運(yùn)用R軟件對(duì)治傷風(fēng)顆?？垢忻白饔冒悬c(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析并繪制柱狀圖; 為闡明靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用，進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，以P<0.05、FDR<0.05為閾值篩選顯著富集的通路，并將通路與靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 治傷風(fēng)顆粒活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn))和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出治傷風(fēng)顆粒的主要活性成分及作用靶點(diǎn)(見表1), 有效成分最多的是甘草; 刪除重復(fù)成分后，得到活性成分共146種，其中中藥成分142種，西藥成分4種(對(duì)乙酰氨基酚、無水咖啡因、鹽酸那可汀、馬來酸氯苯那敏)。

表1 治傷風(fēng)顆粒主要活性成分及靶點(diǎn)信息表

2.2 疾病靶點(diǎn)

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出在感冒相關(guān)度得分均值(3.04分)以上的1 418個(gè)基因作為疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因。應(yīng)用R軟件繪制治傷風(fēng)顆?；钚猿煞职悬c(diǎn)基因與感冒靶點(diǎn)基因交集韋恩圖，共得到117個(gè)共同靶點(diǎn)基因，見圖1。

圖1 治傷風(fēng)顆粒與感冒作用靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 治傷風(fēng)顆粒復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape軟件繪制治傷風(fēng)顆?？垢忻暗膹?fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共得到258個(gè)節(jié)點(diǎn)及1 114條邊，見圖2。從活性成分角度分析，含有活性成分最多的藥物為甘草; 度值最高的成分為槲皮素(MOL000098，度值65)、山奈酚(MOL000422，度值26)、木犀草素(MOL000006，度值24)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(MOL003896，度值18)、柚皮素(MOL004328，度值17)、延胡索堿(MOL000787，度值16)、β-谷甾醇(MOL000358，度值16)和西藥成分無水咖啡因(度值15)等，說明這些成分能夠與較多的疾病靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，可能是治傷風(fēng)顆粒發(fā)揮抗感冒藥效的重要成分。從靶點(diǎn)角度分析，PTGS2、HSP90AA1、ESR1、PTGS1、NOS2、PPARG、SCN5A、ESR2、MAPK14、ADRB2等靶點(diǎn)度值較高，這些靶點(diǎn)能與較多的藥物成分發(fā)生相互作用。

圖2 治傷風(fēng)顆粒的復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)117個(gè)交集靶基因進(jìn)行分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)共有117個(gè)節(jié)點(diǎn)，728條邊，平均度值為12.4，見圖3。排名前15位的節(jié)點(diǎn)分別為IL-6、AKT1、INS、VEGFA、MAPK8、STAT3、MAPK1、IL-1β、EGFR、CCL2、PTGS2、APP、MMP9、HSP90AA1、ICAM1，這些靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系緊密，屬于關(guān)鍵靶點(diǎn)，可能在感冒的發(fā)生、發(fā)展及治療中具有十分重要的意義。見圖4。

圖3 治傷風(fēng)顆粒PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 治傷風(fēng)顆粒治療感冒作用靶點(diǎn)頻次分布圖

2.5 GO富集分析

應(yīng)用R軟件將篩選得到的117個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，得到了生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)3個(gè)方面的數(shù)據(jù)。BP涉及細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、抗氧化反應(yīng)(response to oxidative stress)等; CC包括膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)等; MF主要涉及兒茶酚胺結(jié)合(catecholamine binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)等。見圖5。

A: BP富集分析; B: CC富集分析; C: MF富集分析。

2.6 KEGG通路富集分析

將篩選得到的117個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共篩選出P<0.05和FDR<0.05的前20位顯著富集通路，并將通路與靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，其中富集基因較多的通路為流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)等，見圖6、7。

圖6 治傷風(fēng)顆粒治療感冒作用KEGG通路分析圖

3 討 論

本研究經(jīng)篩選得到治傷風(fēng)顆粒的活性成分146種，其中的中藥成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、柚皮素、延胡索堿、β-谷甾醇等可能是發(fā)揮抗感冒藥效的關(guān)鍵成分。該復(fù)方中含有大量黃酮類成分，度值排名前5位的中藥成分也均為黃酮類?，F(xiàn)代藥理研究[4-5]表明，黃酮類成分具有明顯的解熱抗炎、增強(qiáng)免疫的作用，其中木犀草素在體內(nèi)外均有較強(qiáng)的抗炎活性[6], 可通過AKT/Nrf2、NF-κB途徑對(duì)小鼠肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用[7]; 山奈酚能通過抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子而發(fā)揮抗炎作用[8]。上述結(jié)果提示治傷風(fēng)顆粒發(fā)揮抗感冒的作用可能與參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)相關(guān)[9]。此外，槲皮素在體內(nèi)外均可發(fā)揮抗病毒作用[10]; 槲皮素-7-葡糖苷能夠通過早期抑制病毒復(fù)制而治療人鼻病毒2(HRV2)引起的普通感冒[11]; 柚皮素既能抑制氣道黏蛋白5AC的分泌以降低痰液的黏稠度，又能促進(jìn)氣道纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)功能以促進(jìn)痰液的排出，還能通過促進(jìn)漿液分泌以稀釋痰液，使痰液易于咳出，發(fā)揮顯著的祛痰作用[12]。

治傷風(fēng)顆粒中的西藥成分主要有對(duì)乙酰氨基酚、無水咖啡因、鹽酸那可汀和馬來酸氯苯那敏。對(duì)乙酰氨基酚具有解熱、鎮(zhèn)痛等作用，為臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥[13]; 氯苯那敏是一種羥基胺類抗組胺藥，可抑制過敏反應(yīng)，減少氣道分泌物，緩解咳嗽癥狀[14]; 鹽酸那可汀為支氣管解痙性鎮(zhèn)咳藥，能解除支氣管平滑肌痙攣，抑制肺牽張反射引起的咳嗽; 咖啡因在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中是度值最高的西藥成分，作為一種中樞興奮劑，咖啡因能增強(qiáng)解熱鎮(zhèn)痛療效并拮抗抗組胺藥所致的嗜睡作用[15]。通過PPI網(wǎng)絡(luò)得到IL-6、AKT1、INS、VEGFA、MAPK8等15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，可能在抗感冒藥效產(chǎn)生過程中具有重要的作用。IL-6為最核心靶點(diǎn)，與45個(gè)蛋白均有相互關(guān)聯(lián)，其是一類多功能蛋白質(zhì)分子，參與機(jī)體的抗感染免疫和自身免疫[16], 研究[17]表明抑制IL-6在治療多種炎性疾病中具有重要的作用。

GO分析和KEGG通路富集分析得出治傷風(fēng)顆?？垢忻暗纳镞^程和代謝通路，其生物學(xué)進(jìn)程從細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)、機(jī)體代謝到應(yīng)激反應(yīng)等。IL-17信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等均被證實(shí)與免疫、炎癥及細(xì)胞調(diào)節(jié)等功能相關(guān)，涉及IL-6、IL-1β、MAPK1、MAPK8等基因。研究[18]表明，AGE-RAGE信號(hào)傳導(dǎo)途徑與炎癥密切相關(guān)，可激活MAPK和NF-κB途徑，影響免疫和氧化應(yīng)激反應(yīng); NF-κB信號(hào)通路是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[19-20]; Toll樣受體能夠參與機(jī)體急性上呼吸道炎性反應(yīng)的病理生理過程[21], 還能夠激活胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB, 引起IL-6等促炎因子的分泌，從而介導(dǎo)免疫[22], 在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、存活及增殖中發(fā)揮顯著的作用; MAPKs能夠參與炎癥反應(yīng)過程、調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)[23]。此外，流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、前列腺癌通路等也有較高的富集，說明該復(fù)方的活性成分作用于多種類型的代謝通路，其發(fā)揮抗感冒療效有著復(fù)雜的機(jī)制。

圖7 治傷風(fēng)顆粒治療感冒作用的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了治傷風(fēng)顆粒治療感冒的有效成分及作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)和“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮藥效的特點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在理論上為治傷風(fēng)顆粒治療感冒的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制的探索提供了一些有利條件，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，為其深入開發(fā)及臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。