彭俊付，彭繼升，王銳，劉超，王振彪

本研究背景：

結(jié)直腸癌是嚴重威脅我國居民健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別居我國惡性腫瘤的第三位和第四位。目前，結(jié)直腸癌的具體發(fā)病機制尚不完全清楚，關(guān)于MOS基因與結(jié)直腸癌生物學(xué)特征及患者預(yù)后關(guān)系的研究報道少見。

本研究價值：

本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織MOS基因表達情況發(fā)現(xiàn)，MOS基因在結(jié)直腸癌組織中的高表達與腫瘤浸潤程度及患者預(yù)后不良相關(guān)，提示MOS基因有可能作為結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)測患者預(yù)后的有價值的生物標(biāo)志物。

本研究局限性：

本研究樣本量有限，未能深入探索原癌基因MOS基因在結(jié)直腸癌進展中的具體作用及相關(guān)機制。

結(jié)直腸癌是全世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第四位，死亡率高居所有惡性腫瘤第二位［1］。有公開研究數(shù)據(jù)顯示，僅2015年間我國新發(fā)結(jié)直腸癌患者多達38萬人（包括男性患者22萬人和女性患者16萬人），因結(jié)直腸癌死亡的患者多達19萬人（包括男性患者11萬人和女性患者8萬人）；結(jié)直腸癌發(fā)病年齡段集中在60～74歲（占總體新發(fā)患者的41%）；45歲以上患者占總體新發(fā)患者的93%，因結(jié)直腸癌死亡率高達95%［2-3］。因此，結(jié)直腸癌已成為嚴重危害我國居民特別是中老年人群身體健康的重大疾病，而提高結(jié)直腸癌診療水平是目前亟須解決的醫(yī)療難題之一。

深入了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的病理生理機制、發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌進展有關(guān)的生物標(biāo)志物對結(jié)直腸癌的早期診斷及靶向治療具有極其重要的臨床意義［4-5］。MOS基因是一種原癌基因，主要編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶并可通過直接磷酸化MEK而激活MAPK信號通路［6］。生理狀態(tài)下，MOS蛋白在胚胎階段或發(fā)育中的生殖系統(tǒng)（如卵巢、睪丸、附睪組織）中表達水平較高，在發(fā)育成熟的組織中表達水平較低［7］。既往研究表明，MOS蛋白在卵細胞的發(fā)育、成熟及睪丸雄性生殖細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用［8-9］；近年研究發(fā)現(xiàn)，MOS基因表達異常與畸胎瘤［10-11］、小細胞肺癌［12］、非小細胞肺癌［13］、卵巢腺癌［14］、甲狀腺髓樣癌［15］等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但MOS基因與結(jié)直腸癌的關(guān)系尚不清楚，關(guān)于結(jié)直腸癌患者MOS基因表達情況及其臨床意義的研究報道較少見。本研究旨在分析結(jié)直腸癌患者MOS基因表達情況及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)后評估、生物標(biāo)志物及治療靶點研究等提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2009年10月—2019年6月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院初診為結(jié)直腸癌并行手術(shù)治療的患者86例作為研究對象，其中男49例，女37例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前未行新輔助放、化療或其他治療；（2）術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為原發(fā)性結(jié)直腸癌；（3）腫瘤組織及癌旁組織均保留有液氮冷凍標(biāo)本；（4）臨床、病理及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜18歲或＞80歲；（2）有其他腫瘤病史；（3）伴有家族性結(jié)腸息肉病等遺傳性疾??；（4）合并其他部位腫瘤或消化道疾病。

1.2 方法 采用動物組織總RNA提取試劑盒〔RNAprep pure Tissue Kit，天根生化科技有限公司（北京）〕提取所有患者結(jié)直腸癌組織及癌旁組織RNA，提取產(chǎn)物的OD260/OD280比值控制在1.8～2.0；采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔TIANScript RT Kit，天根生化科技有限公司（北京）〕合成第一鏈cDNA；以編碼磷酸甘油醛脫氫酶的GAPDH基因作為內(nèi)參基因（GAPDH正向引物序列為5'-GACTCACCCTGCCCTCAATA-3'，反向引物序列為5'-CCCTGTAGCCTGGACCTGAT-3'），MOS基因正向引物序列為5'-CGGTGTTCCTGTGGCCATAA-3'，反向引物序列為5'-AGCAGGCCGTTCACAACATC-3'。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環(huán) 40 次，72 ℃延伸5 min；取PCR產(chǎn)物10 μl，采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳以確定擴增產(chǎn)物長度是否符合預(yù)期，并將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序以確定擴增產(chǎn)物是否為預(yù)期基因序列；采用SYBR Green試劑盒（Takara，日本）對cDNA進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR），引物序列同上。RT-qPCR體系包括SYBR? Premix Ex Taq（2×）（Tli RnaseH Plus）10 μl、cDNA 2 μl、 上 游 引 物 0.4 μl、 下 游 引 物0.4 μl、ROX Reference Dye（50×）Ⅱ 0.4 μl、去離子水 6.8 μl，條件：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃ 5 s、60 ℃34 s循環(huán)40次。采用ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行擴增，重復(fù)3次取平均值。采用2-ΔΔCt法計算MOS基因相對表達量。

1.3 隨訪情況 所有患者出院后進行門診隨訪或電話隨訪；以失訪（作為刪失數(shù)據(jù)）或患者死亡為隨訪終點，隨訪截至2020年8月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。經(jīng) Kolmogorov-Smirnov檢驗，本研究所有計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制Kaplan-Meier生存曲線以分析患者生存情況，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗。MOS基因表達情況與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織MOS基因表達情況 結(jié)直腸癌組織MOS基因相對表達量為（4.56±2.17），高于癌旁組織的（3.12±1.65），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.636，P＜0.001），見圖 1。

圖1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織MOS基因相對表達量比較Figure 1 Comparison of relative expression quantity of MOS gene between colorectal cancer tissues and paracancerous tissues

2.2 MOS基因表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)結(jié)直腸癌組織MOS基因相對表達量的平均值（3.76±2.20）將所有患者分為MOS高表達組（n=43）和MOS低表達組（n=43）。兩組患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率、遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；MOS高表達組患者中TNM分期為T3～4期者所占比例高于MOS低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 MOS基因表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系〔n（%）〕Table 1 Relationship between MOS gene expression level and clinicopathological features of patients with colorectal cancer

2.3 MOS基因表達水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系所有患者隨訪6～125個月，中位隨訪時間為61.3（24.8，97.8）個月。繪制Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)，MOS高表達組、MOS低表達組患者中位生存期分別為101個月〔95%CI（92.4，112.6）〕、116個月〔95%CI（105.6，128.7）〕，兩組患者Kaplan-Meier生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.984，P=0.029），見圖2。

圖2 MOS高表達組和MOS低表達組患者的Kaplan-Meier生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves for patients with high and low expression of MOS gene

以MOS基因表達水平及患者臨床病理特征為自變量，以結(jié)直腸癌患者預(yù)后為因變量進行Cox比例風(fēng)險回歸模型分析（變量賦值見表2），結(jié)果顯示，MOS基因高表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素（P＜0.05），見表3。

表2 結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析的變量賦值Table 2 Variable assignment in Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

表3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析Table 3 Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

3 討論

結(jié)直腸癌是一種在生物學(xué)上存在高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，多數(shù)結(jié)直腸癌患者在確診時即已處于中晚期，預(yù)后較差。近年來，隨著分子靶向治療和免疫治療在腫瘤臨床治療中的推廣與應(yīng)用，結(jié)直腸癌的分子病理診斷與臨床治療也已進入一個新階段，而針對結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的研究對于結(jié)直腸癌的早期診斷、有針對性地制定臨床治療方案、準(zhǔn)確進行預(yù)后評估均具有重要臨床意義。目前，針對結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的研究主要涉及KRAS基因、NRAS基因、BRAF基因、PI3KCA基因、人類表皮生長因子受體2（HER2）基因、癌胚抗原（CEA）等［16］。

既往研究表明，30%～45%的結(jié)直腸癌患者存在KRAS基因突變，4%的結(jié)直腸癌患者存在NRAS基因突變，KRAS、NRAS基因突變均可引起表皮生長因子受體（EGFR）-RAS-ERK信號通路異常激活，進而導(dǎo)致結(jié)直腸癌對抗EGFR化療藥物產(chǎn)生耐藥性［17］。此外，KRAS基因突變還可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物［18-19］。BRAF基因所編碼的蛋白產(chǎn)物是RASMEK-MAPK信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，與腫瘤細胞生長、分化、凋亡、自噬等多種生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)。有研究表明，5%～15%的結(jié)直腸癌患者存在BRAF基因功能性突變，其中V600E突變與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)［20］。另有研究表明，存在BRAF基因突變的結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)率明顯升高，因此BRAF基因可作為預(yù)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物［21］。近年來，多種孤立的生物標(biāo)志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如SFAKIANAKI等［22］研究發(fā)現(xiàn)，PKM2基因高表達的結(jié)直腸癌患者無病生存期及總生存期均明顯短于PKM2基因低表達者，且PKM2基因表達水平可作為結(jié)直腸癌患者對奧沙利鉑耐藥的生物標(biāo)志物。

MOS基因位于8號染色體（8q11-12），編碼39-kDa的蛋白，并主要通過MAPK信號通路介導(dǎo)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其中較為重要的生物學(xué)效應(yīng)是對脊椎動物細胞減數(shù)分裂的調(diào)控作用。動物實驗表明，MOS基因敲除小鼠體內(nèi)存在由于卵子細胞周期異常終止而導(dǎo)致的生育力嚴重損傷［23］。研究表明，正常組織中MOS基因及其編碼的蛋白表達水平較低，且在不同組織中二者表達水平存在顯著異質(zhì)性，但MOS基因在體細胞中的具體作用目前尚不清楚［24］；MOS蛋白可與多種細胞功能相關(guān)蛋白相結(jié)合，如vimentin波形蛋白、tubulin微管蛋白及熱休克蛋白hsp70、p34、p35等［25-27］。PERUNOVIC等［23］研究發(fā)現(xiàn)，體細胞中MOS基因表達水平升高與腫瘤轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，其可能的作用機制包括以下兩個方面：（1）MOS-MAPK信號通路異常激活通過干擾體細胞Cyclin D1-Cdk4-pRb-E2F信號通路而擾亂正常的細胞周期［28］；（2）MOS基因表達水平升高導(dǎo)致體細胞獲得減數(shù)分裂樣表型，進而導(dǎo)致有絲分裂檢查點異常［29］。此外，還有研究表明MOS基因在肺癌組織中高表達并會促進腫瘤細胞生長、對相對良好的患者預(yù)后具有負面影響［30］。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織MOS基因相對表達量高于癌旁組織，MOS高表達組患者中TNM分期為T3～4期者所占比例高于MOS低表達組且兩組患者Kaplan-Meier生存曲線間存在統(tǒng)計學(xué)差異，MOS基因高表達是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素之一，提示MOS基因高表達與結(jié)直腸癌浸潤程度及患者預(yù)后不良相關(guān)，并有可能作為結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)測患者預(yù)后的有價值的生物標(biāo)志物，也可能成為結(jié)直腸癌患者的潛在治療靶點，而作為原癌基因，MOS基因在腫瘤進展中的作用、對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)效應(yīng)及包括MAPK信號通路在內(nèi)的信號通路的影響、相關(guān)作用機制等仍需繼續(xù)深入探索。

作者貢獻：彭俊付進行文章的構(gòu)思、研究的設(shè)計與可行性分析，撰寫論文；彭繼升進行論文及英文的修訂；王銳負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；劉超、王振彪進行文獻檢索、病例資料收集與整理、實驗操作及結(jié)果分析。

本文無利益沖突。