劉曉艷，葉月華，錢 敏,2，白衛(wèi)東,*，黃漢聰，楊 紅，何一龍

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；3.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225；4.廣州市如豐果子調(diào)味食品有限公司，廣東 廣州 510300）

醬油是我國(guó)經(jīng)久不衰的傳統(tǒng)調(diào)味品，流傳歷史長(zhǎng)達(dá)兩千余年，至今在人們?nèi)粘ｏ嬍持腥哉紦?jù)著無可取代的地位。它的精髓源自于其獨(dú)一無二的風(fēng)味，即香味和滋味等方面，主要是由一系列微生物在釀造過程中共同作用所形成復(fù)雜的物質(zhì)組分。由于風(fēng)味成分含量會(huì)隨著醬醪發(fā)酵過程中原料和微生物菌群的變化以及某些成分間的相互反應(yīng)而有所改變，醬油的品質(zhì)與發(fā)酵時(shí)間息息相關(guān)[1]。其中頗具代表性的是高鹽稀態(tài)醬油，耐鹽微生物能夠充分發(fā)揮作用，產(chǎn)生大量醇類、酯類和有機(jī)酸等風(fēng)味物質(zhì)，因此其醇厚的口感和濃郁的酯香深受大眾青睞，但不足之處是釀造周期長(zhǎng)和成本高[2]?，F(xiàn)代工藝為了確保大產(chǎn)量和縮短發(fā)酵周期從而通過機(jī)械化生產(chǎn)高鹽稀態(tài)醬油，這勢(shì)必會(huì)成為中國(guó)醬油行業(yè)未來發(fā)展的趨勢(shì)[3]。

醬油獨(dú)特的釀造工藝和具有特殊的風(fēng)味，使其風(fēng)味成分的研究一直以來備受學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。迄今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要采用直接溶劑萃取法、同時(shí)萃取蒸餾法和固相微萃取法等萃取方法結(jié)合高效液相色譜、氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜等方法對(duì)醬油揮發(fā)性成分進(jìn)行分離和鑒定[4]。其中最常使用的是基于分析速度快、靈敏度高和可同時(shí)進(jìn)行分離和鑒定等特點(diǎn)的氣相色譜-質(zhì)譜法，例如高獻(xiàn)禮[5]利用固相微萃取結(jié)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中的香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定出74 種物質(zhì)，其中最突出的香氣化合物有乙酸和3-甲基丁酸；李楊等[6]則采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定出當(dāng)?shù)蒯u油發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣組分共計(jì)31 種。Wei Quanzeng等[7]也是使用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法動(dòng)態(tài)追蹤醬油不同發(fā)酵階段揮發(fā)性物質(zhì)的變化，結(jié)果鑒定出119 種揮發(fā)性化合物。

然而當(dāng)前針對(duì)醬油釀造過程風(fēng)味成分變化規(guī)律的文獻(xiàn)相對(duì)較少，且對(duì)大型發(fā)酵醬油滋味層面物質(zhì)的分離和鑒定尚未深入研究，目前有關(guān)醬油揮發(fā)性成分的研究報(bào)道也多集中于氣相色譜-質(zhì)譜方法[8-9]。相比傳統(tǒng)質(zhì)譜分析，高分辨率的飛行時(shí)間質(zhì)譜則存在更多優(yōu)勢(shì)，比如靈敏度和采集速率更高，可在極短時(shí)間內(nèi)快速完成同等測(cè)量工作，選擇性更突出，操作更簡(jiǎn)便，定性范圍更廣，尤其是分析組分復(fù)雜的樣品等方面[10-11]。因此，為了更好地指導(dǎo)高檔醬油的生產(chǎn)以及提高我國(guó)醬油的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，本實(shí)驗(yàn)率先采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）技術(shù)對(duì)高鹽稀態(tài)醬油在機(jī)械化釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行更全面有效的分析，并獲得醬油在釀造過程中的重要風(fēng)味組分，以期為今后該領(lǐng)域的相關(guān)科研工作者和醬油生產(chǎn)企業(yè)提供更充足的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取自廣州市如豐果子調(diào)味食品有限公司醬油發(fā)酵車間同一批次不同發(fā)酵時(shí)間的醬油樣品，分別是釀造第1、11、21、32、52、62天的醬醪樣品，發(fā)酵周期為62 d。

甲醇（67-56-1，色譜純） 美國(guó)CNW Technologies公司；吡啶（110-86-1，色譜純） 美國(guó)Adamas公司；甲氧銨鹽（593-56-6，分析純） 美國(guó)TCI公司；L-2-氯苯丙氨酸（103616-89-3，純度≥98%）上海恒柏生物科技公司；硅烷化試劑（1%三甲基氯硅烷，V/V） 美國(guó)REGIS Technologies公司；飽和脂肪酸甲酯 美國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀、DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司；PEGASUS HT質(zhì)譜儀 德國(guó)Leco公司；Heraeus Fresco17離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 物質(zhì)提取

取樣本100 μL于1.5 mL EP管中，加入400 μL甲醇提取液，再加入10 μLL-2-氯苯丙氨酸，渦旋30s；超聲10 min（冰水?。?；將樣本4 ℃、12 000 r/min離心15 min；小心移取50 μL上清液于1.5 mL EP管中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶，20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min；向每個(gè)樣品中加入100 μL硅烷化試劑（含有1%三甲基氯硅烷，V/V），將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL飽和脂肪酸甲酯（溶于氯仿）；隨機(jī)順序上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 GC-TOF-MS測(cè)定

GC條件：進(jìn)樣量1 μL；采用不分流模式；隔墊吹掃流速3 mL/min；載氣He；DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；柱流速1 mL/min；升溫程序：50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫到310 ℃，保持8 min。

TOF-MS條件：進(jìn)樣口溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度250 ℃；電子能量－70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z50～500，掃描速率12.5 spectra/s，溶劑延遲時(shí)間6.17 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理及作圖

使用ChromaTOF軟件（V4.3x，LECO）對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析[10]。物質(zhì)定性使用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫，包括質(zhì)譜匹配及保留時(shí)間指數(shù)匹配。采用Excel 2010作圖，TBtools 1.04繪制熱圖，SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油釀造過程中風(fēng)味化合物的鑒定

如圖1所示，本次實(shí)驗(yàn)中共檢出523 個(gè)峰。通過相似度檢索，從醬油樣品中共鑒定出了210 種成分。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，可將它們分為12 類，分別為氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、糖類及其衍生物、醇類、胺類、酚類、酮類、酯類、醛類、烴類、鹽類及其他。其中氨基酸及其衍生物有49 種，有機(jī)酸有47 種，糖類及其衍生物有30 種，醇類有19 種，胺類有18 種，酯類有9 種，酮類有4 種，醛類有3 種，烴類有3 種，酚類有1 種，鹽類2 種，其他25 種。以下把含量甚微且種類少的揮發(fā)性化合物歸為其他類物質(zhì)，由此得到氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、糖類及其衍生物、醇類、胺類和其他類共7 大類物質(zhì)。

圖1 不同時(shí)期醬油樣品的GC-TOF-MS總離子流圖Fig.1 GC-TOF-MS total ion current chromatograms of soy sauce mesh samples at different fermentation times

整個(gè)釀造周期不同釀造時(shí)間點(diǎn)的6 份醬醪樣品中種類最多的為氨基酸及其衍生物（31.235%～71.830%）和有機(jī)酸（12.839%～22.345%），其次是胺類（1.348%～3.340%）和其他類化合物（2.502%～3.880%），而糖類及其衍生物（1.720%～39.289%）和酯類（0.123%～0.480%）在釀造后期變化最大。醇類化合物在這一釀造階段中變化不太明顯。

2.2 醬油釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的組成

由圖2可知，在發(fā)酵初期，檢測(cè)出的風(fēng)味物質(zhì)的種類有175 種；第11～32天，風(fēng)味化合物的種類變化有所上升，最高有198 種；第32～52天時(shí)，其風(fēng)味化合物的種類稍有下降，有189 種，此時(shí)各風(fēng)味物質(zhì)的總相對(duì)含量持平，變化不大；但到第62天化合物種類急劇下降至54 種。醬油釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的種類前中期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，末期持續(xù)下降。說明在醬油釀造期間，其主要風(fēng)味物質(zhì)的形成是在釀造前中期產(chǎn)生的。發(fā)酵末期風(fēng)味化合物種類的減少，可能是這個(gè)階段又有酵母菌參與賦香發(fā)酵，在增加風(fēng)味成分的同時(shí)難免會(huì)抑制某些化合物之間的反應(yīng)，從而導(dǎo)致成品中化合物的種類有所減少[12-14]。

圖2 醬油不同釀造時(shí)間風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量及化合物數(shù)量Fig.2 Changes in relative contents and types of flavor substances in soy sauce mesh with fermentation time

釀造過程中，氨基酸及其衍生物在前11 d呈現(xiàn)快速增加的趨勢(shì)，之后增加趨勢(shì)變緩。由于醬醪中的主力菌種是米曲霉，發(fā)酵前期米曲霉產(chǎn)生的大量蛋白酶分解原料蛋白，使氨基酸及其衍生物快速累積；第11天后曲霉的生長(zhǎng)基本停止，但醬醪中的酶仍發(fā)揮作用[15]，因此氨基酸及其衍生物相對(duì)含量增長(zhǎng)變緩。整個(gè)發(fā)酵過程中丙氨酸和亮氨酸含量增加明顯，它們對(duì)醬油的鮮味產(chǎn)生重要的影響，鮮味是醬油中最突出的味道[16]。

有機(jī)酸和糖類及其衍生物的相對(duì)含量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。醬油中有機(jī)酸主要由乳酸菌發(fā)酵、酵母菌發(fā)酵、脂肪酸降解和氨基酸降解后氧化還原產(chǎn)生，醬油釀造過程中由于乳酸和L-蘋果酸的相對(duì)含量明顯降低而造成有機(jī)酸總相對(duì)含量下降，很可能是后期乳酸菌和酵母由于競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)素和產(chǎn)生的特殊代謝產(chǎn)物互相抑制生長(zhǎng)從而降低了有機(jī)酸的含量[17]。糖類及其衍生物是發(fā)酵過程中微生物進(jìn)行生命活動(dòng)的底物和能量來源，而微生物的生命活動(dòng)始終貫穿整個(gè)醬油釀造過程，所以醬油中糖類及其衍生物整體相對(duì)含量不斷減少[18]。醬油發(fā)酵過程中糖類及其衍生物含量大幅度下降主要源于果糖、核糖、龍膽二糖等化合物含量的降低。

醇類物質(zhì)可以為醬油帶來醇的酒香氣味和一種怡人的花草香氣[19]。釀造過程中醇類化合物的相對(duì)含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，其中含量變化較大的為肌醇。釀造第1天醇類化合物的相對(duì)含量為1.664%，到第32天增加到2.728%，這時(shí)的醇類物質(zhì)主要來源于酵母乙醇發(fā)酵和氨基酸的代謝，后又下降至2.000%，可能是因?yàn)榇碱愇镔|(zhì)會(huì)與有機(jī)酸反應(yīng)生成重要的酯類物質(zhì)。

釀造過程中的胺類物質(zhì)和酯類物質(zhì)含量在全部風(fēng)味成分中占比不大，其他風(fēng)味成分在發(fā)酵過程中也不斷累積，因此它們的相對(duì)含量維持在一定范圍內(nèi)。胺類物質(zhì)主要是由微生物的氨基酸脫羧酶對(duì)游離氨基酸脫酸反應(yīng)產(chǎn)生的，氣味刺激，容易造成醬油釀造初期時(shí)帶來的惡臭味[20]。

釀造過程中其他類化合物的相對(duì)含量呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，其他類化合物雖然含量很低，但因?yàn)樗耐悺⑷╊?、酚類等物質(zhì)種類多從而豐富了醬油的風(fēng)味層面。

2.3 醬油釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的熱圖分析及PCA

2.3.1 醬油釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的熱圖分析

氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸和糖類及其衍生物等多種風(fēng)味物質(zhì)是評(píng)判醬油滋味的重要質(zhì)量指標(biāo)，酯類、醇類、胺類和一些其他物質(zhì)如醛類、吡啶類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)盡管含量甚微，但種類繁多，因此是構(gòu)成醬油風(fēng)味的重要物質(zhì)來源。為了進(jìn)一步研究釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化，選取在釀造過程中檢測(cè)到的含量變化較為突出的136 種風(fēng)味物質(zhì)并對(duì)其含量變化進(jìn)行熱圖分析，可以直觀地表現(xiàn)出這6 個(gè)時(shí)期組分的差異，紅色越深代表含量越高，藍(lán)色越深則代表含量越低，結(jié)果如圖3所示。

圖3 醬油釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)含量變化的熱圖Fig.3 Heatmap showing changes in the contents of flavor components in soy sauce mesh during the brewing process

從圖3A可以看出，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、乳酸、L-蘋果酸、3-氨基異丁酸、鳥氨酸、核糖和果糖這13 種化合物在釀造過程中含量的變化是比較明顯的，說明這13 種化合物對(duì)醬油的風(fēng)味有著至關(guān)重要的影響。丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸在整個(gè)釀造過程中的含量不斷增加，甘氨酸的含量在釀造前期有所增加，中期開始減少，但在末期時(shí)增加到最大值。丙氨酸和甘氨酸能夠?yàn)獒u油提供甜味和鮮味[21]，能增強(qiáng)醬油的調(diào)味效果，還能改善醬油中有機(jī)酸的酸味，使醬油風(fēng)味變得柔和，起到味感緩沖作用；而纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸呈苦味，微量的苦味能給醬油增添醇厚感，賦予醬油獨(dú)特的風(fēng)味[22-23]。脯氨酸、乳酸、L-蘋果酸、核糖和果糖的含量則在整個(gè)釀造過程中呈現(xiàn)下降的狀態(tài)，但L-蘋果酸相對(duì)含量最高，L-蘋果酸酸度比檸檬酸大，酸味大卻柔和，具有持久性[24]；核糖和果糖等糖類及其衍生物主要由淀粉酶解生成，是醬油甜味的主要來源，能對(duì)醬油滋味有一定的緩沖作用，還能與氨基酸等一同起風(fēng)味協(xié)調(diào)作用[25]。而3-氨基異丁酸和鳥氨酸在釀造前期含量不斷增加，到釀造后期開始持續(xù)減少。其他氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸和糖類及其衍生物等含量在釀造過程中增加和減少的趨勢(shì)與這13 種化合物相比則較為緩慢。

從圖3B可以看出，酯類、醇類、胺類等物質(zhì)中，2-羥基吡啶、1,5-脫水葡萄糖醇、肌醇、乙醇胺和尿嘧啶這5 種化合物在釀造過程中含量的變化比較明顯，其中，2-羥基吡啶在釀造前期含量先減少，隨著釀造時(shí)間的延長(zhǎng)，到釀造后期又逐漸增加。1,5-脫水葡萄糖醇在釀造前期變化大，但在釀造后期含量大幅減少。肌醇、乙醇胺和尿嘧啶在整個(gè)釀造過程中含量不斷增加，增加的速度與其他化合物相比較為迅速。醇類和酯類物質(zhì)明顯能賦予醬油濃郁的醇香和酯香[26]，還可抑制發(fā)酵必然產(chǎn)生的胺類化合物所帶來的刺激感和苦味，因此揮發(fā)性物質(zhì)的作用不可小覷[27-29]。

2.3.2 不同釀造時(shí)期醬油風(fēng)味物質(zhì)的PCA

對(duì)不同釀造時(shí)間高鹽稀態(tài)醬油的風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量值標(biāo)準(zhǔn)化后，利用PCA方法對(duì)其原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理[30-32]，從氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、糖類及其衍生物、酯類、醇類、胺類和其他物質(zhì)共7 大類物質(zhì)中提取出2 個(gè)PC（特征值＞1），如表1所示。PC1貢獻(xiàn)率為51.52%，PC2貢獻(xiàn)率為39.34%，所提取的2 個(gè)PC總貢獻(xiàn)率達(dá)到90.86%，能充分客觀地反映醬油釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化趨勢(shì)。

表1 PCA的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 1Eigenvalues of first two principal components and their contribution rates

如圖4A所示，在PC1軸上，氨基酸及其衍生物、醇類及酯類物質(zhì)呈正相關(guān)，而糖類及其衍生物呈負(fù)相關(guān)，氨基酸及其衍生物及糖類物質(zhì)是醬油中鮮味及甜味的主要來源，說明PC1反映了醬油主要特征風(fēng)味化合物在釀造過程的影響；PC2軸顯示，有機(jī)酸、胺類、酯類及其他類物質(zhì)的相關(guān)性系數(shù)較大，因此可用PC2解釋這4 類物質(zhì)，主要反映醬油中起修飾性的酸味及香味化合物在釀造過程的影響。

圖4 醬油樣品的載荷圖（A）和得分圖（B）Fig.4 PCA loading (A) and score (B) plots for soy sauce mesh samples at different fermentation times

從圖4B可以看出，所有樣品在橫軸上的投影較遠(yuǎn)，說明發(fā)酵過程對(duì)于醬油的鮮甜味有較強(qiáng)相關(guān)性。對(duì)于同一釀造階段的樣品在PC1上投影距離大于在PC2的投影距離，說明PC1對(duì)同一釀造階段的樣品有更好的解釋能力，發(fā)酵過程對(duì)氨基酸及其衍生物和糖類及其衍生物的影響較大。

而在PC2軸上，第1天的樣品與其他釀造時(shí)間的樣品距離較遠(yuǎn)，說明第1天的樣品與其他樣品的差異性較大。除第21天的樣品，釀造前期的樣品都分布在PC2軸上方，而釀造后期的樣品都分布在PC2軸下方，說明PC2能較好地區(qū)分前酵和后酵期間的風(fēng)味組分，有機(jī)酸、胺類、酯類和其他類物質(zhì)對(duì)不同釀造階段的樣品解釋能力較大。

3 結(jié) 論

大型發(fā)酵高鹽稀態(tài)醬油在機(jī)械化生產(chǎn)過程中可對(duì)釀造過程的溫度等環(huán)境條件進(jìn)行人工控制，能夠確保醬油產(chǎn)量和品質(zhì)的同一性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大型發(fā)酵醬油釀造過程進(jìn)行跟蹤取樣，采用GC-TOF-MS技術(shù)對(duì)高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，利用PCA法對(duì)不同釀造時(shí)間醬醪樣品的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。

氨基酸及其衍生物是醬油中含量最多的風(fēng)味化合物；不同釀造時(shí)間段醬醪樣品中的化合物種類不斷減少，其相對(duì)含量變化也較明顯。發(fā)酵前11 d，氨基酸及其衍生物的相對(duì)含量迅速增加，而糖類及其衍生物、有機(jī)酸的相對(duì)含量快速減少；之后，氨基酸及其衍生物、糖類及其衍生物、有機(jī)酸的變化趨勢(shì)變緩。醇類、酯類、胺類物質(zhì)和其他類物質(zhì)的相對(duì)含量在發(fā)酵過程中變化不大。熱圖分析表明，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、乳酸、L-蘋果酸、3-氨基異丁酸、鳥氨酸、核糖、果糖、2-羥基吡啶、1,5-脫水葡萄糖醇、肌醇、乙醇胺和尿嘧啶在釀造過程中含量的變化始終比較明顯，說明這18 種化合物對(duì)醬油風(fēng)味有至關(guān)重要的影響。從不同釀造時(shí)間醬醪樣品的風(fēng)味物質(zhì)中提取的2 個(gè)PC的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到90.86%，結(jié)果顯示所有樣品與PC1呈較好的相關(guān)性，表明發(fā)酵過程對(duì)貢獻(xiàn)醬油鮮甜味的氨基酸及其衍生物和糖類及其衍生物影響較大。第1天樣品與PC2呈較好的相關(guān)性，表明第1天樣品對(duì)貢獻(xiàn)修飾風(fēng)味的有機(jī)酸、胺類、酯類其他類物質(zhì)影響也較為顯著。