胡 陽，晏 幸，伍 菱，李利君，楊遠(yuǎn)帆，杜希萍，翁淑燚，倪 輝,*，李清彪

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；4.大閩食品（漳州）有限公司，福建 漳州 363000）

柚皮苷是一種黃烷酮糖苷類物質(zhì)，在柚、酸橙等柑橘水果中含量豐富，可占黃酮總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的75%以上[1]。較多的研究工作已經(jīng)揭示，柚皮苷等黃酮類化合物具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基的能力，還可以調(diào)節(jié)Ras/Raf/Erk信號通路[2]，因此在醫(yī)藥工業(yè)上，柚皮苷可用于生產(chǎn)防治心腦血管疾病、抗癌、抗病毒、降脂、降血糖、鎮(zhèn)痛、清熱及消炎等藥物[3]。在食品工業(yè)上，柚皮苷既可作為天然色素、風(fēng)味改良劑和苦味劑用于食品、飲料的生產(chǎn)[4-5]，又可經(jīng)羥醛綜合反應(yīng)得到查耳酮中間體后，再進(jìn)一步催化加氫而制得新型甜味劑柚皮苷二氫查耳酮和新橙皮苷二氫查耳酮。這兩種甜味劑不僅甜度高，分別為蔗糖的500～700 倍和1 500～1 800 倍，而且甜味持久而且安全性高，是新一代無毒、低能量、防齲齒的高甜度的甜味劑[6-7]。此外，柚皮苷還能用于制備多種高附加值的有機(jī)物如鼠李糖、檸檬素、酸性偶氮染料以及具有更高生物活性和藥用價(jià)值的半合成黃酮類化合物，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[8]。

柚皮苷提取方式主要包括：水提法、有機(jī)溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、酶輔助提取法等[9]。目前，柚皮苷提取的原料主要是柑橘水果加工剩余的皮渣及殘次爛果等。除成熟的柑橘類果實(shí)外，相關(guān)研究表明柑橘幼果中也含有一定量的柚皮苷，且幼果中的柚皮苷含量通常高于成熟的果實(shí)。劉春榮等[10]研究表明常山胡柚小青果柚皮苷含量為24.95 mg/g；李則靈等[11]在用豐都紅心柚落果制備柚皮素的過程中，發(fā)現(xiàn)早期落果的柚皮苷含量比成熟期的含量大。近年來，研究證實(shí)柚類水果中柚皮苷等黃酮類化合物的合成高峰期處于未成熟的果期，隨著果實(shí)的成熟含量顯著下降[12]。由于柑橘水果生產(chǎn)管理過程中，人們常摘除20%～30%左右過密幼果（疏果管理），從而保障果實(shí)不會因過密而引起養(yǎng)分供給不足[13]。根據(jù)以上研究判斷，柑橘類的幼果不僅柚皮苷含量比成熟果實(shí)高，而且具有一定的產(chǎn)量，因此，其可能是一種潛在的柚皮苷提取原料。

李秀娟[14]研究了中國特有柑橘屬植物果實(shí)主要黃烷酮含量及其動態(tài)變化，結(jié)果表明沙田柚果皮在幼果期的柚皮苷含量為75.21 mg/g，宜昌橙果皮在幼果期的柚皮苷含量為30.89 mg/g，爪畦檸檬果皮在幼果期的柚皮苷含量為0.52 mg/g，馬蜂柑果皮在幼果期的柚皮苷含量為1.25 mg/g。林勵等[15]研究了不同產(chǎn)地土壤橘紅的柚皮苷含量，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地表土層Ca豐度對柚皮苷含量有顯著影響。韓寒冰等[16]對化橘紅果實(shí)生長發(fā)育過程中類黃酮的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了化橘紅果齡15～60 d時(shí)，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)從52.5%降到了16.1%；田靜等[17]研究了化州柚不同發(fā)育期柚皮苷的含量變化，發(fā)現(xiàn)果皮和果肉中的柚皮苷含量均隨著果徑的增大而降低；劉佳等[18]對不同果期梅州沙田柚的柚皮苷進(jìn)行測定，結(jié)果顯示5月初采摘的沙田柚未成熟果實(shí)柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)20.68%。以上研究表明，柑橘品種（柚類幼果柚皮苷含量最高）、種植地、發(fā)育期對幼果柚皮苷含量具有顯著影響。

琯溪蜜柚（Citrus maxima(Burm.) Merr.）原產(chǎn)于福建省平和縣，以其肉質(zhì)地柔軟，汁多化渣，口感酸甜適中等優(yōu)良品質(zhì)而享譽(yù)海內(nèi)外，是中國特有的優(yōu)良柚類品種[19-20]。目前，琯溪蜜柚種植面積達(dá)4.33萬 hm2，年產(chǎn)量達(dá)120多萬 t[21]，按照20%～30%的疏果量估算，琯溪蜜柚每年疏果量大約20萬～35萬 t。本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定柚皮苷含量，分析研究種植地海拔、果實(shí)部位、果期、貯藏時(shí)間及干燥加工等對琯溪蜜柚幼果中柚皮苷含量的影響規(guī)律，旨在為利用琯溪蜜柚幼果提取柚皮苷提供含量變化方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

琯溪蜜柚采于福建省平和縣，其果實(shí)的生長成熟期如圖1所示，幼果期主要為4—5月份。乙腈、甲醇（色譜純）、柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；無水乙醇（分析純） 上海沃凱生物技術(shù)有限公司；所有用水均為純水機(jī)制備的超純水（電導(dǎo)率18.2 MΩ·cm）。

圖1 琯溪蜜柚生長的不同果期Fig.1 Photographs of Guanxi pomelo fruit at different growth stages

1.2 儀器與設(shè)備

JP-500C型高速粉碎機(jī) 永康市久品工貿(mào)有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BS 124 S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ5200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9146烘箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UliMate 3000 HPLC儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚皮苷分析方法的建立

參考實(shí)驗(yàn)室前期測定蜜柚中柚皮苷含量的方法[22]，選取新鮮蜜柚幼果粉碎，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液進(jìn)行超聲輔助提取黃酮，提取條件為料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間50 min、提取溫度35 ℃、功率200 W，超聲結(jié)束后真空抽濾，定容。取10 mL定容后的提取液，旋蒸至干，再加入10 mL甲醇并利用超聲波輔助溶解，過0.22 μm濾膜進(jìn)行HPLC分析。采用UliMate 3000 HPLC儀，色譜柱為AlltimaTMC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣體積為10 μL；流動相流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為283 nm；溶劑體系由超純水（流動相A）和乙腈（流動相B）組成。梯度洗脫條件為：0～5 min，95% A、5% B；5～10 min，95%～75% A、5%～25% B；10～35 min，75%～55% A、25%～45% B；35～40 min，55%～95% A、45%～5% B。

HPLC測定柚皮苷的數(shù)據(jù)利用外標(biāo)法定量分析，根據(jù)柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（Y=29 022X－522 173），按下式計(jì)算柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到被測組分溶液的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為提取液旋干的樣品溶液體積/mL；V2為旋干樣品復(fù)溶后的定容體積/mL；m為樣品溶液所代表試樣的質(zhì)量/g。

1.3.2 幼果發(fā)育期和種植海拔高度對幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

選取如表1所示4 個(gè)發(fā)育期（幼果I、II、III和IV期）的琯溪蜜柚幼果，分別種植于海拔高度40 m（福建省漳州市平和縣小溪鎮(zhèn)）和海拔高度668 m（福建省漳州市平和縣霞寨鎮(zhèn)）2 個(gè)地區(qū)，該區(qū)域均為“琯溪蜜柚之鄉(xiāng)”平和縣蜜柚種植示范基地，屬亞熱帶季風(fēng)氣候。選取的果實(shí)用液氮碾碎進(jìn)行超聲提取，超聲提取條件為：超聲溶劑70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間50 min、提取溫度35 ℃、功率200 W，超聲提取液經(jīng)過處理后進(jìn)行HPLC檢測分析。

表1 琯溪蜜柚不同發(fā)育期幼果的外觀形狀及大小Table 1Appearance, shape and size of young Guanxi pomelo fruit at different development stages

1.3.3 幼果表皮及內(nèi)部白囊柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨果實(shí)發(fā)育期的變化

選取高海拔地區(qū)（668 m）種植的琯溪蜜柚不同生長期幼果，將表皮和內(nèi)部白囊分離，液氮碾碎進(jìn)行超聲提取，超聲提取條件為：超聲溶劑70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間50 min、提取溫度35 ℃、功率200 W，超聲提取后進(jìn)行HPLC檢測分析。

1.3.4 貯藏時(shí)間對幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

選取高海拔地區(qū)（668 m）種植的I期琯溪蜜柚幼果進(jìn)行常溫貯藏，每隔2 d取樣1 次，隨著貯藏時(shí)間的延長，表皮逐漸變?yōu)辄S色，根據(jù)肉眼觀察果皮變黃程度估算著黃比例進(jìn)行分類（圖2）。將不同貯藏程度的幼果表皮和內(nèi)部白囊分離，液氮碾碎后超聲提取，超聲提取條件為：超聲溶劑70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間50 min、提取溫度35 ℃、功率200 W，超聲提取后進(jìn)行HPLC檢測分析。

圖2 不同貯藏期幼果顏色變化Fig.2 Color changes of young pomelo fruit at different storage stages

1.3.5 干燥處理對幼果中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

選取高海拔地區(qū)（668 m）種植不同生長期的幼果，將綠色表皮和內(nèi)部白囊分離，在熱風(fēng)溫度90 ℃、熱風(fēng)風(fēng)速0.6 m/s條件下進(jìn)行熱風(fēng)干燥處理至材料恒質(zhì)量，再將干燥后的材料粉碎進(jìn)行超聲提取，超聲提取條件為：超聲溶劑70%乙醇溶液、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間50 min、提取溫度35 ℃、功率200 W，超聲提取液進(jìn)行HPLC檢測分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 幼果中柚皮苷的HPLC分析

根據(jù)文獻(xiàn)[23]對蜜柚果實(shí)各組織分類方式，取各部位蜜柚幼果的超聲提取液進(jìn)行HPLC分析檢測，發(fā)現(xiàn)樣品中有一個(gè)大峰而其他的都是小峰，如圖3所示，將大峰與柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行對比，在0.05 s的時(shí)間誤差內(nèi)，大峰與柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品完全對應(yīng)，因此可以判斷此物質(zhì)為柚皮苷。用柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外標(biāo)法定量分析，本研究標(biāo)準(zhǔn)曲線柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=29 022X－522 173（X為柚皮苷質(zhì)量濃度（μg/mL）；Y為峰面積），R2=0.999。該R2符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求，并與劉文靜等[24]用HPLC法分析柑橘屬果實(shí)中類黃酮成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線相似，表明本研究柚皮苷濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線在本測試的線性范圍內(nèi)是可靠的。

圖3 蜜柚幼果柚皮苷和柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.3 Liquid chromatograms of naringin standard and naringin in pomelo fruit

2.2 幼果發(fā)育期和種植海拔高度對幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

柑橘類水果中柚皮苷合成途徑[25-26]如圖4所示。柑橘水果中柚皮苷等黃酮類化合物的合成高峰期處于未成熟的果期，隨著果實(shí)的成熟含量顯著下降[12]。由于不同種植海拔受到的光照時(shí)間及強(qiáng)度不同，可能會影響柚皮苷的含量。分別選取不同發(fā)育期和種植海拔高度（海拔落差約600 m）蜜柚幼果，將整個(gè)果實(shí)處理后進(jìn)行柚皮苷含量的檢測，結(jié)果如圖5所示。高海拔地區(qū)（668 m）種植的I、II、III和IV期幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.25%、15.54%、13.63%和11.46%，低海拔地區(qū)（40 m）種植的I、II、III和IV期幼果柚皮苷分別為13.67%、11.27%、7.59%和6.03%。該結(jié)果顯示，琯溪蜜柚幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨發(fā)育期的增長逐漸下降；該現(xiàn)象與相關(guān)研究報(bào)道總黃酮濃度隨蜜柚長大而降低[24]的結(jié)論一致，其原因與果實(shí)組織中與查爾酮合酶和查爾酮異構(gòu)酶基因表達(dá)的下調(diào)有關(guān)[25-26]。此外，相同發(fā)育期的幼果，高海拔地區(qū)（668 m）種植的果實(shí)柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)大于低海拔地區(qū)（40 m）；這些規(guī)律與相關(guān)研究在其他柑橘水果中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律相似[12,27-28]；其原因是高海拔地區(qū)紫外線輻射較強(qiáng)，可誘導(dǎo)促進(jìn)植物體內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶等黃酮合成酶的活性和基因表達(dá)水平升高[27-28]，從而促進(jìn)黃酮類化合物積累，以減少紫外輻射對自身的傷害[29]。

圖4 柑橘水果中黃酮類物質(zhì)代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways of flavonoids in citrus fruits

圖5 幼果發(fā)育期和種植海拔高度對幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effects of growth period and planting altitude on naringin content in young pomelo fruit

2.3 幼果表皮及內(nèi)部白囊柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨果實(shí)發(fā)育期的變化

幼果果實(shí)的果肉尚未發(fā)育，主要由果皮的綠色皮層和白色囊衣組成，表皮呈現(xiàn)綠色，含有葉綠素，容易同柚皮苷一起提取出來造成柚皮苷提取率下降，影響產(chǎn)品純度及色澤。如果把表皮去除，可能會引起柚皮苷大量損失。分別對來自高海拔地區(qū)（668 m）的不同發(fā)育期幼果表皮和內(nèi)部白囊進(jìn)行柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測，結(jié)果如圖6所示。在幼果期I，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且內(nèi)部白囊中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與表皮中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差值最大。隨著果實(shí)的生長發(fā)育，綠色表皮和內(nèi)部白囊的柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈顯著下降趨勢，其中綠色表皮和內(nèi)部白囊的柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差值不斷縮小。到幼果期IV時(shí)，白色內(nèi)部白囊的柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)首次低于綠色柚皮。造成這個(gè)結(jié)果的原因是鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶在柚子幼果期中雖有表達(dá)，但隨著果實(shí)發(fā)育時(shí)間的延長，鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶降低表達(dá)，從而使柚皮苷含量逐漸下降[30]。幼果期I柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，這一時(shí)期的果實(shí)最適宜用作提取柚皮苷的原料，此外，內(nèi)部白囊質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.95%，其明顯高于表皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.78%，為避免表皮中的色素對產(chǎn)品品質(zhì)的影響，建議去除綠色表皮層，相對于其他幼果期，此時(shí)去除表皮對提取率的影響最小。

圖6 不同幼果期幼果表皮及內(nèi)部白囊的柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.6 Naringin contents of young pomelo fruit at different growth stages

2.4 幼果貯藏過程中（表皮由綠變黃）柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

相關(guān)研究表明，貯藏對柑橘類果實(shí)中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有影響，熊蘭蘭[31]研究發(fā)現(xiàn)紅綿柚、白肉柚和紅肉柚成熟果肉中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著貯藏天數(shù)增多而降低。莊滿賢等[32]研究發(fā)現(xiàn)毛橘紅柚皮苷含量隨著貯存時(shí)間的延長而升高。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間延長，果皮顏色由綠色變?yōu)辄S色，對變黃程度分別為0%、20%、50%、80%和100%的幼果（圖2）進(jìn)行柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定，結(jié)果如圖7所示。在果皮從0%到100%變黃的過程中，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷提高，變黃率100%時(shí)，表皮和內(nèi)部白囊的柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)都達(dá)到最大，分別是28.33%和26.48%。產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能是幼果中的某些初級代謝產(chǎn)物在貯藏過程中轉(zhuǎn)化形成黃酮類次生代謝產(chǎn)物。因此，在利用琯溪蜜柚幼果提取柚皮時(shí)，將果實(shí)貯藏至全部黃色時(shí)進(jìn)行柚皮苷提取，柚皮苷的提取得率將最大。該結(jié)果不同于Shamloo等[33]報(bào)道的成熟蜜柚的果肉中柚皮苷等黃酮物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著貯藏時(shí)間延長而減少，其原因可能是蜜柚成熟期不同，但與莊滿賢等[32]研究毛橘紅柚皮苷隨貯藏時(shí)間變化結(jié)果相似。

圖7 不同貯藏期幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.7 Changes in naringin contents in young pomelo fruit at different storage stages

2.5 干燥處理對幼果中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

Farahmandfar等[34]發(fā)現(xiàn)對水果和蔬菜進(jìn)行貯存、加工，尤其是加熱會導(dǎo)致黃酮類成分顯著損失?，g溪蜜柚的疏果時(shí)間非常短，為避免幼果原料變質(zhì)腐爛，需要將原料進(jìn)行妥善保存。干燥是食品保存的常用手段之一，Ledesma-Escobar等[35]發(fā)現(xiàn)，干燥過程中黃酮類化合物可能會被其他酶（如氧化酶）氧化或者降解，導(dǎo)致黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。如圖8所示，不同的幼果期果實(shí)，表皮干燥后柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)從18.78%、11.98%、10.31%、9.46%分別下降至11.68%、8.59%、8.38%、6.64%；白囊干燥后柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)從22.95%、15.54%、13.63%、8.29%分別下降至15.22%、11.94%、10.41%、5.76%，表明干燥工藝對柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響。黃酮類化合物主要存在于蜜柚果皮細(xì)胞內(nèi)的液泡中[36]，干燥會使果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致柚皮苷的釋放，從而增加了柚皮苷與酶的接觸[37]，更容易造成柚皮苷的降解。因此，在原料沒有過剩的情況下不宜對果實(shí)原料進(jìn)行干燥，干燥處理應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化干燥方式與干燥參數(shù)，選擇最優(yōu)干燥工藝。

圖8 蜜柚幼果表皮和白囊干燥處理前后的柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.8 Naringin contents in the epidermis and albedo of young pomelo fruit before and after drying

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)種植地海拔、果實(shí)發(fā)育期、果實(shí)部位、貯藏時(shí)間及干燥等因素對琯溪蜜柚幼果柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有顯著影響；其中，高海拔地區(qū)（668 m）種植的琯溪蜜柚幼果中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于低海拔地區(qū)（40 m）；隨著發(fā)育期的增長，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降，且內(nèi)部白囊與綠色表皮中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差值不斷縮??；同一時(shí)期采摘的幼果經(jīng)貯藏后，果實(shí)由綠變黃的過程中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷升高；加熱干燥處理會顯著降低新鮮幼果表皮及內(nèi)部白囊柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本實(shí)驗(yàn)闡明種植地海拔、果實(shí)發(fā)育期、果實(shí)部位、貯藏時(shí)間及加熱干燥對琯溪蜜柚幼果中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，為琯溪蜜柚幼果作為柚皮苷提取原料提供參考。