吳倩蓉，朱 寧,*，陳 松，周慧敏，李 素，趙 冰，劉 夢，潘曉倩，張順亮，喬曉玲

（1.中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068；2.河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司，河南 漯河 462000）

醬牛肉是我國傳統(tǒng)醬鹵肉制品之一，已有上千年的歷史，產(chǎn)品肉質(zhì)鮮嫩，香味濃郁，營養(yǎng)豐富，高蛋白低脂肪，同時富含維生素和礦物質(zhì)[1-2]，深受消費者喜愛。醬牛肉風(fēng)味是影響消費者選擇的重要因素之一，醬牛肉加工過程中，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的降解、氨基酸的Strecker降解、氨基酸與還原糖之間的Maillard反應(yīng)、香辛料及輔料等的復(fù)雜反應(yīng)，共同形成和影響醬牛肉的風(fēng)味[3-4]，蛋白質(zhì)降解對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成具有很重要的作用。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是目前使用較廣泛的一種蛋白質(zhì)分離鑒定方法，主要依據(jù)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量進(jìn)行分離，具有操作簡單、分辨率高、結(jié)果直觀等優(yōu)點[5-8]，能夠較為直觀地反映蛋白降解程度。頂空固相微萃取是常見的樣品前處理方法之一，對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行富集，具有快速、無損、無溶劑等優(yōu)點[9]，與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用，被廣泛運用于分析各種食品的風(fēng)味[10-13]。在醬牛肉的加工過程中，對成品的二次殺菌是十分必要的，二次殺菌能夠延長產(chǎn)品貨架期[14]，過低的殺菌溫度不能有效殺滅致病菌，但過高的殺菌溫度對肉制品的口感、質(zhì)地、風(fēng)味以及營養(yǎng)等都有很大的影響，對于傳統(tǒng)肉制品而言，確定一個合適的殺菌溫度，在確保產(chǎn)品安全的基礎(chǔ)上保證其風(fēng)味及營養(yǎng)等品質(zhì)是十分必要的。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對醬牛肉的研究較多，Legako等[15]研究了不同等級原料及加工方式對牛肉品質(zhì)的影響；高欣等[16]研究了包裝材料對牛肉品質(zhì)的影響；付麗等[14]研究了不同殺菌條件對醬牛肉品質(zhì)的影響；也有學(xué)者對加工過程、加工方式、加水量、鹽水注射率等對醬牛肉品質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響進(jìn)行了研究[17-20]。但目前對加工過程以及殺菌溫度對傳統(tǒng)醬牛肉制品蛋白降解及風(fēng)味變化影響的研究相對較少。本研究對加工過程及不同殺菌溫度醬牛肉（原料肉，滾揉、煮制、90 ℃、105 ℃、110 ℃、120 ℃殺菌樣品）中蛋白質(zhì)量濃度、氮含量、蛋白粒徑、蛋白表面疏水性進(jìn)行測定分析，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時采用HS-SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，以期確定對風(fēng)味物質(zhì)影響最小的殺菌溫度及樣品蛋白降解、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律，為傳統(tǒng)醬牛肉的工業(yè)化以及風(fēng)味調(diào)控以及進(jìn)一步研究蛋白降解與風(fēng)味形成機(jī)制的關(guān)系提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬牛肉 北京月盛齋清真食品有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、溴酚藍(lán)、1 mol/L Tris-HCl緩沖液、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液、彩虹245廣譜蛋白Marker、30%丙烯酰胺混合液 北京索萊寶科技有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、SDS、三氯乙酸、濃硫酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高效凱氏定氮催化劑片 北京金元興科科技有限公司；1-苯氨基萘-8-磺酸銨 上海源葉生物科技有限公司；2-甲基-3-庚酮標(biāo)準(zhǔn)品、系列正構(gòu)烷烴、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZT1000殺菌釜 諸城中泰機(jī)械有限公司；D-500勻漿機(jī) 德國Wiggens公司；Synergy H4酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；UKD159凱氏定氮儀 北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；24DN制膠器 北京市六一儀器廠；EPS-300X電泳儀 美國C.B.S.Scientific公司；TS-200脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Gel-Doc-XR型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Zetasizer納米粒度電位儀 英國Malvern Panalytical有限公司；HH-1型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 上海至翔科教儀器廠；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；GC-MS聯(lián)用儀、TG-WAX MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

對月盛齋傳統(tǒng)醬牛肉原料肉、滾揉樣品進(jìn)行取樣，并將成品分別在90、105、110 ℃和120 ℃條件下進(jìn)行殺菌，殺菌時間20 min。共7 個取樣點，分別為原料肉、滾揉后樣品、煮制后成品、90 ℃殺菌樣品、105 ℃殺菌樣品、110 ℃殺菌樣品、120 ℃殺菌樣品，記為A、B、C、D、E、F、G。

1.3.2 全肌肉蛋白、水溶性蛋白和鹽溶性蛋白濃度測定

采用Bechtel等[21]的方法并略作調(diào)整，6 g肉樣中加入30 mL提取液（2% SDS，10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0），10 000 r/min勻漿2 min，靜置1 h，4 ℃、8 000 r/min離心7 min，上清液即為全肌肉蛋白溶液。

2 g肉樣中加入40 mL磷酸緩沖液（15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L NaH2PO4），10 000 r/min勻漿2 min，4 ℃、8 000 r/min離心7 min，收集沉淀和上清液，上清液部分即為水溶性蛋白溶液。

上述沉淀部分中加入40 mL提取液（15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L NaH2PO4，0.7 mol/L NaCl），10 000 r/min勻漿2 min，4 ℃靜置過夜，然后4 ℃、8 000 r/min離心7 min，上清液即鹽溶性蛋白溶液。

用BCA蛋白濃度測定試劑盒對提取的全肌肉蛋白、水溶性蛋白及鹽溶性蛋白濃度進(jìn)行測定，測定其在波長562 nm處吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 總氮、水溶性氮、非蛋白氮、蛋白降解指數(shù)的測定

參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[22]，稱取0.5 g樣品中加入2 粒消化片和10 mL濃硫酸，350 ℃消化2 h，用凱氏定氮儀測定總氮含量。

參照Visessanguan等[23]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。稱取10 g樣品，加入50 mL蒸餾水，4 ℃磁力攪拌提取10 min后，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集上清液。向離心后的沉淀中加入50 mL蒸餾水，重復(fù)以上操作，合并上清液。經(jīng)濾紙過濾后取10 mL上清液，加入2 粒消化片和10 mL濃硫酸，350 ℃消化2 h后，用凱氏定氮儀測定濾液中水溶性氮的含量。

取上述濾液按照1∶1加入20%三氯乙酸溶液，常溫靜置0.5 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，取10 mL上清液，加入2 粒消化片和10 mL濃硫酸，350 ℃消化2 h后，用凱氏定氮儀測定濾液中非蛋白氮的含量。蛋白降解指數(shù)按式（1）計算：

1.3.4 SDS-PAGE測定

參考Laemmli[24]的方法，制備不連續(xù)SDS-PAGE系統(tǒng)，并適當(dāng)調(diào)整優(yōu)化。

分離膠的制備：12%分離膠，需30%丙烯酰胺混合液3.6 mL，1.5 mol/L的Tris-HCl（pH 8.8）2.25 mL，10% SDS 0.09 mL，去離子水2.97 mL，10%過硫酸銨0.09 mL，四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）0.003 mL。用吸管吸取4～4.5 mL分離膠溶液，沿隔板加入凝膠模具內(nèi)，小心避免產(chǎn)生氣泡，在分離膠溶液上覆蓋一層1～5 mm的水層，使分離膠表面變得平整，并防止凝固過程中變干。等待30～60 min，使凝膠聚合。

濃縮膠的制備：4%濃縮膠，需30%丙烯酰胺混合液0.67 mL，1.0 mol/L的Tris-HCl（pH 6.8）0.625 mL，10% SDS 0.05 mL，去離子水3.625 mL，10%過硫酸銨0.05 mL，TEMED 0.004 mL。吸去水層，用吸管吸取濃縮膠緩慢加入至玻璃板頂端，插入梳子，聚合30～40 min后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內(nèi)，預(yù)先接好電極，將電泳緩沖液加入內(nèi)外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。

制備樣品和上樣：調(diào)整水溶性蛋白和鹽溶性蛋白質(zhì)量濃度分別為3 mg/mL和2 mg/mL，取40 μL樣品，加入10 μL 5×上樣緩沖液并混合均勻，煮沸變性10 min。樣品上樣量為20 μL，彩虹245廣譜蛋白Marker上樣量為5 μL。

電泳：將電泳儀電壓調(diào)至80 V恒壓約30 min，使樣品通過濃縮膠；電泳儀調(diào)節(jié)電壓至120 V恒壓約1～1.5 h，等樣品跑至凝膠底部，關(guān)閉電源。

染色與脫色：將凝膠放入容器中，加入沒過凝膠的考馬斯亮藍(lán)染液，在搖床上振蕩染色1 h。棄去染液，將凝膠在水中漂洗后加入沒過凝膠的脫色液，振蕩過夜后成像并觀察結(jié)果。

調(diào)整水溶性蛋白和鹽溶性蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，用Zeta sizer納米粒度電位儀測定蛋白質(zhì)粒徑。水溶性蛋白分散劑為水，鹽溶性蛋白分散劑為0.7 mol/L NaCl溶液。

1.3.6 水溶性、鹽溶性蛋白表面疏水性

1.3.6.1 水溶性蛋白表面疏水性

參考Yongsawatdigul等[25]的方法。將水溶性蛋白用0.01 mol/L磷酸緩沖液配成質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL的蛋白溶液，取4 mL溶液加入20 μL 8 mmol/L的1-苯氨基萘-8-磺酸銨溶液，旋渦混勻，避光10 min，測定樣品熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.3.6.2 鹽溶性蛋白表面疏水性

參考Chelh等[26]的方法。使用0.01 mol/L磷酸緩沖液+0.7 mol/L NaCl，調(diào)整鹽溶性蛋白質(zhì)量濃度為4 mg/mL，取1 mL樣品，加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，旋渦混勻10 min，空白為1 mL磷酸緩沖液+200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，本底為磷酸緩沖液（上機(jī)時扣除）。4 000 r/min離心10 min，取上清液于波長595 nm處測定吸光度（A）。表面疏水性按式（2）計算：

1.3.7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

人工操作對硫酸銅產(chǎn)品存在難以避免的潛在污染，惡劣的工作環(huán)境對員工的職業(yè)衛(wèi)生健康也會產(chǎn)生一定的影響。所以，實現(xiàn)自動化包裝是托盤碼垛［3］包裝發(fā)展的必然趨勢。車間現(xiàn)有兩套硫酸銅包裝系統(tǒng)，包裝規(guī)格均為每袋25kg。硫酸銅生產(chǎn)［4］工序產(chǎn)出的硫酸銅通過螺旋輸送機(jī)輸送至中間倉，硫酸銅在中間倉緩存，再由螺旋輸送機(jī)輸送至計量倉，計量好的硫酸銅灌裝到包裝袋中，再由皮帶輸送至自動封包機(jī)進(jìn)行封包，封包好的硫酸銅再由皮帶輸送至碼垛工位，碼垛后由人工進(jìn)行裝卸車。

切碎并準(zhǔn)確稱量10 g肉樣置于頂空樣品瓶中，加入0.2 g NaCl以及1 μL質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮，用聚四氟乙烯隔墊密封，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入萃取瓶中，于50 ℃水浴中平衡10 min后推出纖維頭開始萃取30 min。然后將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口解吸6 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)，每個樣品重復(fù)3 次取平均值。GC-MS參考貢慧等[27]的方法并適當(dāng)調(diào)整。

GC條件：TG-WAX MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氮氣（＞99.99%），流速1.0 mL/min，不分流；保持2 min。

MS條件：接口溫度260 ℃；傳輸線溫度230 ℃；電壓1.2 kV；電子電離源溫度280 ℃；電子能量70 eV；全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m/z40～600；掃描時間2 s。

定性分析：將所得質(zhì)譜中化合物與NIST、Wiley等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，刪除保留時間大于45 min的無香味高沸點化合物，化合物的確定以正、反相似指數(shù)均大于800為準(zhǔn)，記為M。通過待測物的保留時間與相同條件下正構(gòu)烷烴的保留時間計算待測物的保留指數(shù)（retention index，RI），與文獻(xiàn)值進(jìn)行比對，標(biāo)記為R。RI按式（3）計算：

式中：N為低碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；n為高低碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)差；tx、tN+n、tN分別為待測化合物保留時間、高碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴保留時間和低碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴保留時間/min。

定量分析：通過內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮的含量及峰面積，計算每一種風(fēng)味物質(zhì)相對于內(nèi)標(biāo)物的含量，進(jìn)行定量分析。按式（4）計算：

式中：C為測定的揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；Ax為測定揮發(fā)性化合物的峰面積/（AU·min）；C0為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量質(zhì)量濃度（0.816 μg/μL）；A0為內(nèi)標(biāo)物的峰面積/（AU·min）；V為內(nèi)標(biāo)物的進(jìn)樣量/μL；m為測定樣品的質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、RI、蛋白降解指數(shù)等數(shù)值進(jìn)行計算；用Origin軟件繪圖；利用SPSS Statistics 21.0對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 全肌肉蛋白、水溶性蛋白和鹽溶性蛋白含量測定

如圖1所示，原料肉中3 種蛋白質(zhì)量濃度均為最高，隨加工過程而顯著下降（P＜0.05），這可能是由于加熱使蛋白質(zhì)發(fā)生降解，生成氨基酸；同時蛋白質(zhì)的不可逆變性，使其發(fā)生沉淀，溶解度下降。后期隨著殺菌溫度的升高，全肌肉蛋白質(zhì)量濃度有所增加，而水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的質(zhì)量濃度均有所下降，但變化不顯著，這可能是由于加熱過程中蛋白受熱變性，生成不溶于水和鹽的蛋白凝膠所致，這與鄒良亮[28]、章建浩[29]等的研究結(jié)果一致。對于任意樣品而言，全肌肉蛋白質(zhì)量濃度均為最高，其次是水溶性蛋白，鹽溶性蛋白最低。

圖1 醬牛肉加工過程中3 種蛋白含量的變化Fig.1 Changes in three protein components in sauced beef during processing

2.2 總氮、水溶性氮、非蛋白氮含量變化

圖2a、b表明，醬牛肉加工過程中總氮含量高于水溶性氮和非蛋白氮含量。隨著加工過程的進(jìn)行，總氮含量明顯下降（P＜0.05），這可能是由于熱反應(yīng)使樣品中的蛋白質(zhì)受熱分解生成小肽、游離氨基酸及其他含氮的物質(zhì)造成的；殺菌溫度越高，總氮含量越低，說明高溫加劇了蛋白質(zhì)的降解。水溶性氮和非蛋白氮的變化趨勢基本一致，滾揉后樣品中水溶性氮和非蛋白氮含量均略有降低，這可能是由于滾揉液的加入有一定的稀釋作用，引起水溶性蛋白的流失，使氮含量有所下降；隨著加工過程的進(jìn)行，樣品中蛋白質(zhì)發(fā)生降解等一系列的變化，使水溶性氮和非蛋白氮含量有所增加[30-31]。如圖2c所示，隨著加工過程的進(jìn)行，蛋白質(zhì)降解程度逐漸增加，殺菌溫度的升高加速蛋白質(zhì)的降解。隨著殺菌溫度的升高，蛋白降解指數(shù)的增加速度減慢，這可能是由于殺菌使醬牛肉的質(zhì)構(gòu)發(fā)生顯著變化，水分活度下降、pH值發(fā)生改變等，抑制了蛋白質(zhì)的降解，該結(jié)果與鄒良亮等[28]對高溫處理牛肉中蛋白質(zhì)降解規(guī)律研究結(jié)果相吻合。

圖2 醬牛肉加工過程中總氮（a）、水溶性氮及非蛋白氮（b）含量及蛋白降解指數(shù)（c）Fig.2 Changes in total nitrogen (a), water soluble nitrogen and nonprotein nitrogen (b), and protein degradation index (c) in sauced beef during processing

2.3 SDS-PAGE結(jié)果

如圖3a、b所示，經(jīng)過蒸煮以及不同溫度殺菌后的醬牛肉中水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的SDS-PAGE圖譜具有明顯的變化，但2 種蛋白的譜圖變化規(guī)律相似。未經(jīng)加熱處理樣品（A和B）中蛋白的SDS-PAGE圖譜蛋白質(zhì)量濃度高，基本呈連續(xù)分布且條帶顏色深，說明未經(jīng)加熱處理的樣品中存在多種分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，且未發(fā)生熱變性，蛋白質(zhì)分子中的不耐熱化學(xué)鍵未發(fā)生斷裂。經(jīng)過殺菌的樣品中蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性，大多數(shù)不耐熱的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，電泳條帶明顯變少。如圖3a所示，水溶性蛋白經(jīng)過熱加工后已完全變性，基本沒有明顯條帶，但G組條帶變深，這可能是由于過高的殺菌溫度使蛋白發(fā)生過度聚合，形成了新的聚集體；鹽溶性蛋白SDS-PAGE圖表明，熱處理后樣品中大部分蛋白質(zhì)已完全降解，只有分子質(zhì)量約為35 kDa的肌聯(lián)蛋白和45 kDa的肌動蛋白（熱穩(wěn)定蛋白）依然存在[32]，但隨著溫度的升高，條帶顏色逐漸減弱。

圖3 醬牛肉加工過程中水溶性蛋白（a）及鹽溶性蛋白（b）SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE patterns of water soluble protein (a) and salt soluble protein (b) in sauced beef during processing

2.4 水溶性蛋白、鹽溶性蛋白粒徑分析

如圖4所示，醬牛肉樣品中水溶性蛋白與鹽溶性蛋白粒徑變化規(guī)律基本一致，滾揉后牛肉（B）中水溶性蛋白和鹽溶性蛋白粒徑顯著增加（P＜0.05），這可能是由于滾揉過程使鹽溶蛋白大量析出，與滾揉液中卡拉膠等其他成分結(jié)合形成凝膠體系，蛋白分子間的黏結(jié)性增大，交聯(lián)作用增加，從而導(dǎo)致蛋白粒徑增加；熟制過程使蛋白質(zhì)變性，蛋白分子間不耐熱的化學(xué)鍵斷裂，交聯(lián)作用減弱，蛋白粒徑隨之顯著降低；加熱后蛋白粒徑大小有所波動，但整體變化不大。

圖4 醬牛肉加工過程中蛋白粒徑變化情況Fig.4 Variation in protein particle size in sauced beef during processing

2.5 水溶性蛋白和鹽溶性蛋白表面疏水性分析

如圖5所示，滾揉過程使蛋白質(zhì)表面疏水性明顯上升，這可能是由于滾揉過程破壞了維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵，而促使其向其他結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[33-34]，表面疏水性增強(qiáng)；同時，滾揉液中所含的食鹽，也會使蛋白質(zhì)表面疏水性增大，這與Melander等[35]的研究結(jié)果一致。熟制過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，暴露的疏水面互相作用而發(fā)生聚集，使蛋白分子比表面積減小，表面疏水性顯著降低（P＜0.05）。C～G，隨著殺菌溫度的升高，用于維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力逐漸減弱，氫鍵、范德華力、二硫鍵等遭到破壞，蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，原先位于分子內(nèi)部的一些疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)分子的表面，從而使蛋白質(zhì)表面疏水性增加[34,36]。

圖5 醬牛肉加工過程中蛋白表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of proteins in sauced beef during processing

續(xù)表1

2.6 醬牛肉加工過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化

使用HS-SPME-GC-MS對加工過程中醬牛肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表1所示，不同樣品組分別檢測出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)42、50、79、70、75、79、74 種，包括酯類、醇類、醛類、醚酮類、酸類、烷烴類以及雜環(huán)類物質(zhì)，各類物質(zhì)占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比例如圖6所示。

表1 醬牛肉加工過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 1Relative contents of volatile flavor compounds in sauced beef during processing

圖6 醬牛肉加工過程中各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量Fig.6 Relative contents of each class of volatile flavor compounds in sauced beef during processing

由表1和圖6所示，原料肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最少，為42 種，且物質(zhì)總量最低（79.21 μg/kg）；滾揉后樣品中揮發(fā)性物質(zhì)種類增加至50 種，總量增加至107.82 μg/kg，這是由于滾揉液的加入，增加了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，但變化并不顯著（P＞0.05）。熱加工過程中，由于蛋白質(zhì)受熱降解，生成的氨基酸發(fā)生脫氨、脫羧反應(yīng)生成揮發(fā)性的醇、醛、硫化物等，糖和氨基酸的混合物在加熱時發(fā)生Maillard反應(yīng)以及Strecker降解，生成一系列揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以及煮制料的加入，使熱處理后的醬牛肉樣品（C）中酯類、醇類、醛類、醚酮類、烷烴類和雜環(huán)類物質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05），酸類物質(zhì)含量顯著下降。未殺菌樣品（C）中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最高，達(dá)613.49 μg/kg，不同溫度殺菌后樣品中總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均有所降低，這可能是由于殺菌過程使樣品中酯類、醇類、醛類物質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生降解、氧化等反應(yīng)，使含量發(fā)生變化，這與王明[37]、孫承峰[38]等的研究結(jié)果一致。對于不同殺菌溫度的樣品（D～G），隨著殺菌溫度的升高，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量先增加后減少，105 ℃殺菌樣品（E）中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)顯著高于其他殺菌溫度樣品（P＜0.05），達(dá)577.68 μg/kg，與未殺菌樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量無顯著差異（P＞0.05），這可能是由于一定的溫度能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)和氨基酸的降解及脂質(zhì)的氧化，使正己醇、1-辛烯-3-醇、正辛醇、α-松油醇、壬醛、苯甲醛、羥基丙酮等物質(zhì)含量增加，醛類、酮類物質(zhì)閾值一般較低，對產(chǎn)品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)具有十分重要的作用[39]，但過高的殺菌溫度會造成蛋白質(zhì)的過度變性及氧化，加速酯類物質(zhì)的降解和氧化，正辛醛、壬醛、癸醛、3-蒈烯、2-正戊基呋喃等物質(zhì)含量顯著增加[40-41]。

3 結(jié) 論

對加工過程及不同殺菌溫度醬牛肉樣品（原料肉、滾揉、煮制、90 ℃、105 ℃、110 ℃、120 ℃殺菌）水溶性蛋白和鹽溶性蛋白濃度、蛋白降解指數(shù)、SDS-PAGE、蛋白粒徑、表面疏水性以及樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，7 組樣品中分別檢測出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)42、50、79、70、75、79、74 種，包括酯類、醇類、醛類、醚類等物質(zhì)，總量分別為79.21、107.82、613.49、458.81、577.68、483.58、385.85 μg/kg。滾揉過程以及滾揉液的加入，使蛋白質(zhì)量濃度下降，粒徑和表面疏水性增加，蛋白降解程度不明顯，風(fēng)味物質(zhì)的增加主要來源于香辛料的作用。熱加工過程使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)量濃度及蛋白粒徑、表面疏水性顯著下降，蛋白質(zhì)降解生成風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)，使煮制樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量顯著增加。經(jīng)過殺菌后，各組樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量均有所降低，蛋白降解指數(shù)顯著增加但增加速率逐漸減慢，結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果，過高的殺菌溫度可能造成蛋白的過度變性，形成新的聚合體，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量有所降低。綜上，醬牛肉加工過程中，加工過程能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)降解及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成，但過高的殺菌溫度會影響醬牛肉中蛋白質(zhì)的過度變性及氧化，105 ℃殺菌的醬牛肉風(fēng)味與未殺菌樣品最為接近，顯著高于（P＜0.05）其他殺菌溫度的樣品，為傳統(tǒng)醬牛肉產(chǎn)品的工業(yè)化及風(fēng)味調(diào)控提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究蛋白降解與風(fēng)味形成機(jī)制的關(guān)系提供一定理論基礎(chǔ)。