程景顥，李 杰，付東勇，儲明旭，張 凱，王 濤，尹紹武，唐忠林，茆健強，周國勤

（1.南京師范大學海洋科學與工程學院，江蘇省特色水產育種與綠色高效養(yǎng)殖技術工程研究中心，南京 210023；2.南京市水產科學研究所，南京 210029）

黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）別名黃辣丁、黃姑子、黃沙古、昂刺魚等，隸屬于鲇形目（Siluriformes），鲿科（Bagridae），黃顙魚屬，在我國廣泛分布于長江、黃河、珠江及黑龍江等各水系［1］。黃顙魚屬魚類種類較多，目前我國已報道的有5種，分別為黃顙魚、瓦氏黃顙魚（P.vachelli）、長須黃顙魚（P.eupogon）、中間黃顙魚（P.intermedius）和光澤黃顙魚（P.nitidus）［2］。本研究所選的雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”是以二代選育的瓦氏黃顙魚為父本，三代選育的黃顙魚為母本，所獲得的雜交子代。其生長速度和成活率均高于母本黃顙魚，抗病性強；與父本瓦氏黃顙魚相比，可食用部分多，營養(yǎng)豐富，更耐運輸，深受廣大養(yǎng)殖戶和消費者的歡迎，目前已成為我國重要的優(yōu)質水產養(yǎng)殖品種［3］。

人工授精是魚類人工繁殖的重要環(huán)節(jié)，高質量的精子是保證授精成功的重要因素之一。精子密度是評價精子質量的重要指標，不僅可以用來判斷精液質量的好壞，還直接關系到人工授精的效果。在授精過程中，精子密度過低會降低受精率，過高則會引起多精入卵，導致胚胎發(fā)育后期畸形率增加。因此，魚類人工授精時采用適宜的精子密度是提高受精率與孵化率的關鍵［4］。目前，國內外關于魚類精子密度對人工授精效果影 響 的 報 道 較 多，如 黃 顙 魚［5］、虹 鱒（Oncorhynchusmykiss）［6］、美 洲 擬 鰈（Pseudopleuronectesamericanus）［7］、斑 點 叉 尾 鮰（Ictaluruspunctatus）［8］等。迄今為止，針對雜交黃顙魚的研究主要集中在雌雄差異判別［9］、核型分析［10］、分子標記［11］和精子冷凍保存［12］等方面，而關于精子密度對雜交黃顙魚授精結果影響的研究尚未見報道。

目前，我國雜交黃顙魚已經開展規(guī)?；斯し庇谌斯し敝尺^程中，由于雌、雄魚發(fā)情期不同步且需要殺死父本以獲取精子，從而導致雄魚使用率和子代受精率低［13］。此外，由于瓦氏黃顙魚的市場效益不高，其養(yǎng)殖產量較低，加上近年來過度捕撈，導致瓦氏黃顙魚野生資源日益減少。作為雜交黃顙魚的父本，瓦氏黃顙魚種質資源的衰退對雜交黃顙魚的規(guī)?；品N造成了不利影響。因此，確定雜交黃顙魚人工授精的最佳精子密度，將有利于提高瓦氏黃顙魚精子利用率、減少雄魚宰殺量和優(yōu)化冷凍保存精子的條件。本研究采用8組不同精子密度對雜交黃顙魚開展人工授精實驗，并對所得實驗數據進行統計分析和比較，旨在篩選出最適宜的雜交黃顙魚人工授精精子密度，為雜交黃顙魚規(guī)模化高效制種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 親魚的選擇

雜交黃顙魚親本均為江蘇省南京市水產科學研究所祿口基地自行培育，雄魚瓦氏黃顙魚規(guī)格（300±20）g，雌魚黃顙魚規(guī)格（150±30）g，親魚體質健壯、無傷無病，性腺發(fā)育情況良好。

1.2 精子保存液的制備

本實驗所采用的精子保存液為黃顙魚精子保存專用液［14］，配方如下：NaCl 7.68 g、KCl 0.22 g、NaHCO30.25 g、Na2CO30.21 g、葡萄糖2.0 g、蒸餾水1 L。

1.3 催產藥物及用具

催產藥物選用寧波三生生物科技有限公司生產的促黃體素釋放激素A2（LHRH-A2）、絨促性素（HCG）、馬來酸地歐酮（DOM），開展人工授精實驗時用配制好的保存液對精液進行稀釋。

實驗器具：5 mL連續(xù)注射器、1.5 mL離心管、移液槍、培養(yǎng)皿、奧林巴斯顯微鏡、血球計數板等。

1.4 孵化室及孵化條件

實驗于2020年7月在南京市水產科學研究所祿口基地進行，該基地配備有齊全的設施、專業(yè)的實驗室和孵化室。孵化室內有72個長0.8 m、寬0.5 m的長方形孵化池，并配有完善的充氧設備，每平方米放一個氣石，保證池水中的氧氣供應充足；另設有專用的流水孵化箱，水源為深井水，理化條件穩(wěn)定，pH值7.5～8.0。水源經過晾曬曝氣后加入到孵化池，水溫為（27±1）℃。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗設計

根據前期的預實驗結果，初步優(yōu)化了精卵比例（1粒卵子對應的精子數量，即精子密度），本研究一共設置8個密度梯度：1.0×103、5.0×103、1.0×104、2.5×104、5.0×104、1.0×105、5.0×105、1.0×106個·mL－1，每個梯度設3個重復。每個梯度卵子數量固定為200粒，根據卵子數將每個密度梯度對應數量的精子事先轉入到1.5 mL離心管中，并加入0.9%生理鹽水定容至1 mL。

1.5.2 精液采集與計數

實驗用魚親本捕撈后暫養(yǎng)在水泥池，精液收集采用殺魚取精的辦法。采集精子時剖開雄魚腹腔，用鑷子取出精巢，挑出血絲，在干凈的培養(yǎng)皿中剪碎，用80目的聚乙烯絹布過濾，并用保存液沖洗絹布，將過濾后的精液收集到精子保存液中。

用移液槍取上述精液25μL置于血球細胞計數板，蓋上蓋玻片置于顯微鏡下計數。精子計數的結果為：計數板上半部和下半部計數室中個數的平均值×稀釋倍數［15］，重復計數3次，取其平均值。經計算，瓦氏黃顙魚新鮮精液的精子密度為（1.625±0.589）×1011個·mL－1。經鏡檢，精子活力均在95%以上。

1.5.3 卵子采集

在人工授精前24 h對雌魚注射漁用HCG、LHRH-A2和DOM混合藥物，以促使其卵子成熟。雌魚取卵時，左手抓住黃顙魚，魚頭向內、魚腹向上，用右手大拇指用力擠壓雌魚的腹部，避免魚卵與水接觸［16］。卵子收集后對其活力進行評估，CHATAKONDI和TORRANS［17］認為卵液的pH值與其質量正相關，卵液的pH＞7.4即可以判斷卵子質量合格，經測定實驗卵液pH為7.8。

1.5.4 人工授精及孵化

首先將裁剪好的網片平鋪于紙杯底部，紙杯內襯薄層為植物油脂提取物。實驗前統計黃顙魚卵子密度為（400±15）?！－1，在每個網片上加入0.5 g的卵液；之后將每個密度梯度對應的精子數量用移液槍加入到卵子上面，并輕輕搖晃杯底5 s；然后每個網片加入5 mL的曝氣水（27.5～28.5℃），輕輕搖晃杯底2 min使其充分受精；將網片轉移到孵化池中進行后續(xù)孵化。

孵化方式采用流水孵化，本實驗孵化用水符合《中華人民共和國國家標準：漁業(yè)水質標準（GB11607-1989）》的規(guī)定［18］。受精卵孵化至原腸晚期時，未受精的卵可通過其顏色發(fā)白、不透明的特征進行肉眼辨認，并及時剔除，避免真菌和細菌的感染。此時計數受精卵數，然后繼續(xù)孵化，魚苗出膜后計數出膜魚苗數，之后，等待出膜魚苗發(fā)育至平游期開口攝食，計數開口攝食魚苗數，每個梯度測算的3個樣取其平均數，計算公式如下：

1.6 數據統計分析

各組實驗均重復3次，實驗數據用“平均數±標準差（±SD）”表示。使用Excel 2019和SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析，分別用方差 分 析（ANOVA）、LSD（least significant difference）多重比較和Duncan法檢驗顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 瓦氏黃顙魚精子密度與雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”受精率的關系

在受精卵處于原腸中期時觀察并記數，統計受精率。受精率隨著精子密度的增高呈現先顯著上升后略有下降的趨勢；當精子密度從1.0×103個·mL－1提高到2.5×104個·mL－1時，受精率顯著上升（P＜0.05）；當精子密度為5.0×104時，受精率達到最大值為88.8%；此后，受精率開始下降，但各組之間差異并不顯著（P＞0.05）（圖1）。對8組不同濃度的精子密度與其相應的受精率采用線性函數、對數函數、指數函數、二項式函數和冪函數5種方程進行擬合，并回歸分析，以相關性（R2）最緊密的作為選取型式。結果發(fā)現，二項式函數擬合效果最好：Y＝－2.26X2＋27.29X＋5.49（R2＝0.90）。其中，X代表精子密度，Y代表受精率（圖2）。

圖1 瓦氏黃顙魚精子密度對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”受精率的影響Fig.1 Effect of sperm density of P.vachelli on fertilization rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

圖2 瓦氏黃顙魚精子密度與雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”受精率回歸曲線Fig.2 Regression curve between sperm density of P.vachelli and fertilization rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

綜上可知，精子密度的高低直接影響到雜交黃顙魚的受精率：當精子密度過低時，受精率也往往偏低；精子密度過高時，受精率并不會隨之一直升高，還造成了雄魚配子資源的浪費。當精子密度在2.5×104～1.0×105個·mL－1范圍內時，受精率最理想。

2.2 瓦氏黃顙魚精子密度與雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”孵化率的關系

當精子密度從1.0×103個·mL－1提高到2.5×104個·mL－1時，孵化率顯著上升（P＜0.05），從35.3%提高到83.4%，并在精子密度為2.5×104個·mL－1時達到最大值；而當精子密度從2.5×104個·mL－1提高到1.0×106個·mL－1時，孵化率則隨之下降，在精子密度為1.0×106個·mL－1時，孵化率僅為68.1%（圖3）。由于數據的非線性，采用曲線回歸分析精子密度與孵化率的關系，其中二項式函數擬合效果最好，其方程為：Y＝－2.42X2＋26.73X＋7.90（R2＝0.91）。其中，X代表精子密度，Y代表孵化率（圖4）。

圖3 瓦氏黃顙魚精子密度對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”孵化率的影響Fig.3 Effect of sperm density of P.vachelli on hatching rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

圖4 瓦氏黃顙魚精子密度與雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”孵化率回歸曲線Fig.4 Regression curve between sperm density of P.vachelli and hatching rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

綜上可知，精子密度的大小直接影響到孵化率的高低，但精子密度過高和過低均不能使孵化率達到最大值。當精子密度在2.5×104～5.0×104個·mL－1范圍內時，孵化率最高。

2.3 瓦氏黃顙魚精子密度與雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”出苗率的關系

由圖5可見，當精子密度從5.0×103個·mL－1提高到2.5×104個·mL－1，出苗率顯著上升（P＜0.05），并在精子密度為2.5×104個·mL－1時，出苗率達到最大值（79.4%）。當精子密度繼續(xù)提高，出苗率不再增加。對數據進行回歸分析，發(fā)現二項式R2值最高，擬合效果最好，其方程為：Y＝－1.92X2＋22.18X＋9.42（R2＝0.79）。其中，X代表精子密度，Y代表出苗率（圖6）。當精子密度在2.5×104～1.0×105范圍內時，出苗率最高。

圖5 瓦氏黃顙魚精子密度對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”出苗率的影響Fig.5 Effect of sperm density of P.vachelli on emergence rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

圖6 瓦氏黃顙魚精子密度與雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”出苗率回歸曲線Fig.6 Regression curve between sperm density of P.vachelli and emergence rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

3 討論

在水產動物人工授精時，受精率受到精子密度、卵子質量、授精技術及繁殖環(huán)境等各種因素的影響，但最適宜的精子密度仍是提高受精卵受精率與孵化率的關鍵［19］。BUTTS等［7］認為，當精子密度為3.4×104個·mL－1時，美洲擬鰈卵子的受精率達81.3%；高緒生等［20］在對皺紋盤鮑（Haliotisdiscushannai）的研究中發(fā)現，精子密度在1×105～1×106個·mL－1范圍內時，受精率隨精子密度的增加而提高；SUQUET等［21］認為，精子密度為6×103個·mL－1時，大菱鲆（Scophthalmusmaximus）的孵化率最高；隋錫林等［22］在對刺參（Stichopusjaponicus）的研究中發(fā)現，當精子密度為2×105個·mL－1時，受精率接近100%；BUTTS等［23］研究精子密度對鱈（Gadus morhua）受精的影響時發(fā)現，當精子密度為1×105個·mL－1時，其受精率和孵化率達到最大；BART和DUNHAM［8］發(fā)現，在斑點叉尾鮰人工授精過程中，當一個卵子周圍的精子數量低于5×104個時，會導致受精成功率顯著降低；IANAE等［24］發(fā)現，當精子密度為1×106個·mL－1時，歐洲鰻（Anguillajaponica）的受精率達到最大；LINHART等［25］對鯉（Cyprinuscarpio）的研究發(fā)現，當一個卵子周圍精子數量超過2.4×105個時，其受精率將不再增加。由此可知，精子密度對受精率和孵化率均具有重要影響。

本實驗中，當精子密度在2.5×104～1.0×105個·mL－1范圍內時，受精率最高（可達88.8%）；當精子密度在2.5×104～5.0×104個·mL－1范圍內時，孵化率最高（可達83.4%）；當精子密度在2.5×104～1.0×105個·mL－1范圍內時，出苗率最高（可達79.4%）。由此可見，在雜交黃顙魚實際生產過程中，父本瓦氏黃顙魚精子密度在2.5×104～5.0×104個·mL－1范圍內時，可實現生產效率和經濟效益的最大化。ZHANG等［5］對黃顙魚研究發(fā)現，當精卵比為3×104∶1時，黃顙魚受精率最高為84.1%，本實驗結果與其大致吻合。此外，魯大椿等［26］認為，魚類人工授精適宜采用的精卵比為（3～4）×105∶1，這一結果表明，不同魚類授精的最適精子密度存在差異，在雜交黃顙魚繁殖生產中，可以使用相對較低的精子密度來提高生產效率，從而節(jié)約雄魚親本資源，降低生產成本。

成熟的瓦氏黃顙魚精巢呈現櫛狀分支，每一分支的內部結構呈樹葉型，而精巢小葉又由許多壺腹狀的精小囊組成。成熟的黃顙魚卵呈圓形，且卵子表面僅有1個受精孔，卵膜上有以受精孔為中心分布的輻射狀溝嵴，卵徑為1.0～1.2 mm［27－28］。對于淡水物種，精子自激活后的活躍時間通常只有不到1 min［29］。黃顙魚授精時受精孔區(qū)會出現環(huán)狀隆起，起到一個緩沖作用，只允許少數活性高的精子越過隆起進入精孔管，而大多數活力弱的精子則被阻擋在外面，從而保證授精的質量［30］。本實驗發(fā)現，精子密度為1×103個·mL－1時，雜交黃顙魚的受精率、孵化率和出苗率均偏低，而隨著精子數量的增加，其受精率、孵化率和出苗率均相應的提高。在雜交黃顙魚人工授精過程中，當精子密度過低時，活力高的精子穿過卵膜孔進入精孔管的幾率更小，導致較低的受精率和孵化率；而隨著精子密度的提高，活力高的精子進入精孔管的幾率也大大增加，從而導致受精率的提高。另外，在實驗中還發(fā)現，當精子密度超過一定的閾值，精子數量增加將不再導致生殖力的提高。具體來講，當精子密度超過5.0×104個·mL－1時，受精率將不再提高（圖1）；當精子密度超過2.5×104個·mL－1時，孵化率和出苗率均開始下降（圖3，圖5）。這與對斑點叉尾鮰的研究結果相類似［31］。這可能是由于其受精方式為單精入卵，當精子密度達到一定閾值后，隨著精子密度的提高，活力高的精子進入精孔管的優(yōu)勢不再明顯增加。ROSENTHAL等［32］認為，受精卵在卵裂、受精及孵化變態(tài)過程中耗氧量激增，且精子密度的增加會造成局部溶氧不足，引起孵化水的腐敗，從而影響卵的正常受精與孵化。

本實驗設置8組不同的精子密度（1.0×103～1.0×106個·mL－1）對雜交黃顙魚進行人工授精，并確定了最佳授精精子密度。建議實際生產中宜采用2.5×104～5.0×104個·mL－1的精子密度范圍進行人工授精，該密度使用的精子數量比之前實際生產中使用的要少，可以有效節(jié)約雄魚配子資源，減少人工制種過程中對冷凍保存精子的需求。本實驗篩選出的最適精子密度可作為雜交黃顙魚規(guī)?；a中的最優(yōu)選擇，也可為黃顙魚屬魚類人工授精和雜交育種提供一定的參考和借鑒。