田 鎮(zhèn)，曹 奕，陳愛華，吳楊平，張 雨，陳素華，張志東，李秋潔

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306）

球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）隸屬于金藻門（Chrysophyta），是1938年被首次分離出來的單細(xì)胞藻類［1］，其可以通過自身光合作用，吸收水體中無機氮（主要是氨氮），用于自身生長與繁殖，完成氮素的轉(zhuǎn)移；由于其個體小、繁殖快的優(yōu)勢，球等鞭金藻成為新概念引領(lǐng)下極具潛力的綠色污水處理技術(shù)的主要微型藻類之一［2］。因其營養(yǎng)價值較高，也常作為餌料被用于文蛤（Meretrixmeretrix）、大竹蟶（Solengrandis）、縊蟶（Sinonovaculaconstricta）等雙殼貝類的人工育苗中［3］。

比生長速率是指單位時間內(nèi)單位質(zhì)量的單細(xì)胞生物所增加的生物量，它是反映微藻、細(xì)菌等單細(xì)胞生物生長速率的重要參數(shù)［4］。比生長速率不僅能夠準(zhǔn)確反映出單細(xì)胞藻類在一定時間的特定生長率，更能綜合體現(xiàn)藻類生長與死亡率平衡的動態(tài)變化。響應(yīng)面法是統(tǒng)計學(xué)與數(shù)學(xué)相結(jié)合的方法，它不僅有著正交實驗中的交互作用，還可以利用數(shù)學(xué)模型得到響應(yīng)與各變量之間的函數(shù)關(guān)系式，從而進一步對全部變量因素組合進行預(yù)測得到最優(yōu)響應(yīng)面值，并因其具有實驗次數(shù)少、周期短以及多因素相互作用等諸多優(yōu)勢，近年來被大量應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等多個領(lǐng)域中［5－6］。目前，有關(guān)單細(xì)胞藻類僅見溫度［7－8］、光照［9－10］等單因素對單細(xì)胞藻類生長的影響研究，以及藻類生長繁殖對水環(huán)境（N、P等）的影響研究［11－12］，而環(huán)境因素交互作用對單細(xì)胞藻類生長的研究報道較少見，僅見于采用正交法優(yōu)化小球 藻（Chlorellavulgaris）［13］、雙 鞭 甲 藻（Crypthecodiniumcohni）［14］等單細(xì)胞藻類培養(yǎng)條件，但鮮見球等鞭金藻培養(yǎng)的響應(yīng)面法優(yōu)化的報道。因此，本文以球等鞭金藻比生長速率為指標(biāo)，通過響應(yīng)面法優(yōu)化其在適宜溫度、鹽度及接種量的最佳條件，旨在為球等鞭金藻實驗室培養(yǎng)、規(guī)?；庇忍峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用藻類為江蘇省文蛤良種場所培養(yǎng)的球等鞭金藻藻液，藻類培養(yǎng)海水取自江蘇啟東近海，經(jīng)砂濾池黑暗沉淀處理并經(jīng)二次煮沸后使用。取3 500 mL實驗用水于5 000 mL三角燒瓶中，并加入15 mL的實驗營養(yǎng)液。營養(yǎng)液配方為：25 mg·L－1NaNO3、2.5 mg·L－1K2HPO4、2.5 mg·L－1C6H5FeO7、8 mg·L－1EDTA。所用儀器器皿均采用醫(yī)用酒精消毒后使用。在實驗所設(shè)定的特定光照條件下進行培養(yǎng)，光照強度約為6 000 lx，光照周期為12 h。為避免藻類沉淀，每天搖晃實驗燒瓶2～3次，培養(yǎng)周期為4 d。

1.2 單因素實驗

1.2.1 溫度對球等鞭金藻比生長速率影響實驗

實驗設(shè)置5個溫度梯度：22、24、26、28、30℃，并設(shè)置3組重復(fù)。室溫為22℃，采用加熱板水浴調(diào)控溫度；實驗鹽度為30，藻類接種量為1.30×106個·mL－1，pH為8.7，培養(yǎng)條件及方法同1.1。4 d后利用血球計數(shù)板進行計數(shù)得到最終藻類濃度，并根據(jù)公式計算出球等鞭金藻的比生長速率。

1.2.2 鹽度對球等鞭金藻比生長速率影響實驗

實驗設(shè)置5個鹽度梯度：18、21、24、27、30，并設(shè)置3組重復(fù)。鹽度利用淡水進行稀釋并通過鹽度計進行觀測確定實驗水體鹽度，溫度設(shè)置為22℃，藻類接種量為1.30×106個·mL－1，pH為8.7，培養(yǎng)條件及方法同1.1。4 d后利用血球計數(shù)板進行計數(shù)得到最終藻類濃度，并根據(jù)公式計算出球等鞭金藻的比生長速率。

1.2.3 接種量對球等鞭金藻比生長速率影響實驗

根據(jù)球等鞭金藻母液濃度調(diào)節(jié)實驗瓶中藻類接種量，實驗設(shè)5個接種梯度，0.70×106、1.00×106、1.30×106、1.60×106、1.90×106個·mL－1，并設(shè)置3組重復(fù)。溫度設(shè)置為22℃，鹽度為30，pH為8.7，培養(yǎng)條件及方法同1.1。4 d后利用血球計數(shù)板進行計數(shù)得到最終藻類濃度，并根據(jù)公式計算出球等鞭金藻的比生長速率。

1.3 多因素實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以球等鞭金藻比生長速率為指標(biāo)，運用響應(yīng)面法Box-Benhnken（BBD）模型，選擇3因素3水平的中心組合方案，以溫度（A）、鹽度（B）和球等鞭金藻接種量（C）為主要考察因素，進行響應(yīng)面實驗，實驗因素水平編碼見表1，實驗裝置及方法同1.1。

表1 因素水平表Tab.1 Design table of factors and levels

1.4 比生長速率的測定

球等鞭金藻的比生長速率采用如下公式計算［15］：

式中，C0（106個·mL－1）指藻類的起始濃度，Ct（106個·mL－1）指實驗結(jié)束時藻類的濃度，t（d）指實驗時間，μ（d－1）指球等鞭金藻的比生長速率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

單因素實驗所得數(shù)據(jù)均用Excel 2016整理，并用Origin 8.0作圖。通過SPSS 22.0進行單因素方差分析（one-way ANOVA），若差異顯著（P＜0.05），再作LSD法多重比較。多因素實驗采用Design-expert 8.0軟件BBD模型進行實驗設(shè)計和響應(yīng)面法分析。實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

溫度和鹽度是影響海洋藻類生長的重要環(huán)境因素，會一定程度地影響海洋單細(xì)胞藻類的細(xì)胞分裂周期、酶的活性、吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)的效率，進而影響整個藻類生長繁殖過程［16－18］。單因素研究結(jié)果（圖1，圖2）顯示，當(dāng)溫度在22～30℃時或鹽度在18～30時，球等鞭金藻的比生長速率會呈先升高后降低的趨勢。其中在溫度26℃、鹽度27時，球等鞭金藻的比生長速率達到最大，且溫度和鹽度的交互作用對球等鞭金藻的比生長速率影響顯著（P＜0.05）。這與塔瑪亞歷山大藻（Alexanduriumtamarense）［19－20］、小球藻（Chlorellavulgaris）［13］生長規(guī)律一致。其原因可能是，溫鹽過高或者過低可能會抑制某些酶的活性，降低藻體內(nèi)部的CO2溶解度，使得光合作用下降，進而影響藻體物質(zhì)合成和能量代謝的過程，從而影響其生長繁殖［22－23］。

圖1 溫度對球等鞭金藻比生長速率的影響Fig.1 Effect of temperature on the specific growth rate of Isochrysis galbana

圖2 鹽度對球等鞭金藻比生長速率的影響Fig.2 Effect of salinity on the specific growth rate of Isochrysis galbana

接種量的多少是影響藻類生長繁殖的重要因素，在實際生產(chǎn)過程中，接種量多少會直接影響藻類培養(yǎng)效率［24］。研究結(jié)果（圖3）顯示，球等鞭金藻比生長速率在接種量為（0.70～1.90）×106個·mL－1時呈先增大后減小的趨勢，在1.30×106個·mL－1時，比生長速率達到最大。這可能是由于在接種量為（0.70～1.30）×106個·mL－1時，球等鞭金藻營養(yǎng)充分，比生長速率逐漸升高。當(dāng)超過1.30×106個·mL－1，由于培養(yǎng)基中代謝廢物積累量逐漸增多、營養(yǎng)鹽含量逐漸減少、藻細(xì)胞接觸抑制等原因，球等鞭金藻的生長逐漸受到抑制，甚至停止［25］。這與眼點擬微綠球藻（Nannochloropsisoculata）、三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）、中 肋 骨 條 藻（Skeletonemasp.）的生長規(guī)律一致［26］。

圖3 接種量對球等鞭金藻比生長速率的影響Fig.3 Effect of inoculation level on the specific growth rate of Isochrysis galbana

2.2 響應(yīng)面多因素交叉試驗

為進一步研究溫度、鹽度、接種量3個因素之間的交互作用對球等鞭金藻生長的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到球等鞭金藻的最佳比生長速率。本實驗球等鞭金藻在多因素交叉條件中培養(yǎng)，實驗交叉設(shè)計及結(jié)果見表2。回歸曲線模型表明（表3），F(xiàn)值為30.68，P＜0.000 1，模型的決定系數(shù)（r2）為0.975 3，說明該模型具有較好的擬合性，可以用于3個因素對球等鞭金藻的比生長速率分析。偏差系數(shù)（adeq precision）代表實驗的精確度，偏差系數(shù)越小，實驗的可靠性越高，本次實驗的偏差系數(shù)僅為14.9%，說明本實驗可信。經(jīng)方差分析（表3），溫度的單因素效應(yīng)對球等鞭金藻比生長速率的影響顯著（P＜0.05），鹽度的線性效應(yīng)對球等鞭金藻比生長速率的影響不顯著（P＞0.05），接種量的線性效應(yīng)對球等鞭金藻比生長速率影響不顯著（P＞0.05），溫度、鹽度和接種量3因素間的曲面效應(yīng)都能夠?qū)η虻缺藿鹪灞壬L速率影響極顯著（P＜0.01）。這和單因素實驗中得出的結(jié)論基本相同。通過響應(yīng)面法得出，球等鞭金藻比生長速率預(yù)測值μ對自變量A（溫度）、B（鹽度）和C（接種量）的編碼值二次多項式回歸方程為：

表2 實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Box-Benhnken design with the observed responses

表3 回歸模型方差分析Tab.3 ANOVA for the regression model

球等鞭金藻比生長速率預(yù)測值對實際值自變量A、B和C的二次多項式回歸方程為：

通過對球等鞭金藻生長條件優(yōu)化預(yù)測建立上述模型并繪制響應(yīng)面圖（圖4），得出溫度、鹽度和接種量3個因素的最優(yōu)組合條件為：溫度26.38℃、鹽度26.61和接種量1.29×106個·mL－1。此時球等鞭金藻的比生長速率的預(yù)測值可達0.44 d－1。

圖4 交互作用對球等鞭金藻比生長速率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface showing interactive effects of factors

2.3 模型驗證

通過BBD模型得到球等鞭金藻比生長速率的最優(yōu)條件。選擇同一批藻種，設(shè)計3個平行試驗組，實驗預(yù)測結(jié)果和實際驗證結(jié)果見表4。驗證結(jié)果表明，模型預(yù)測與實際驗證的比生長速率并無顯著性差異（P＞0.05），響應(yīng)面模型分析方法可靠。在實際生產(chǎn)過程中可以利用設(shè)備對各變量進行精準(zhǔn)控制，設(shè)置培養(yǎng)條件為：溫度26℃左右、鹽度27左右、接種量1.30×106個·mL－1左右，以保證球等鞭金藻的比生長速率為最大值。

表4 實驗結(jié)果驗證Tab.4 Experimental results verification