陳龍 單艷敏 田彥軍 崔闊澍

1.河套學(xué)院，內(nèi)蒙古巴彥淖爾

2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站，內(nèi)蒙古呼和浩特

3.鄂托克草原工作站，內(nèi)蒙古鄂托克旗

4.四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川成都

熱激蛋白（heat shock protein，HSP）是一種受外界環(huán)境壓力刺激可在體內(nèi)迅速合成且保守性很高的蛋白，在逆境發(fā)生時，通過與解析蛋白結(jié)合，從而防止蛋白自發(fā)折疊而喪失生物活性[1-2]。根據(jù)熱激蛋白的同源性和分子量可劃分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱激蛋白等家族[3]。小分子熱激蛋白的分子量分布較為分散，大小為12～42 kD，具有保守的α-晶體結(jié)構(gòu)域，在序列結(jié)構(gòu)、分子量大小與功能上具有多樣性且同源性較低[4-6]。此外，小分子熱激蛋白還包括生命必需蛋白[7]。昆蟲小分子熱激蛋白在饑餓脅迫中也具有重要作用，例如，當(dāng)利用RNAi技術(shù)沉默赤擬谷盜HSP18.3基因時，饑餓組的抗性顯著低于對照組[8]。目前，雖然在雙翅目、鱗翅目和膜翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)多種小分子熱激蛋白，但是在其它昆蟲中卻只有很少的小熱激蛋白被鑒定出來[9]，更深入的功能研究則更少[10]。因此，開展昆蟲小分子熱激蛋白的研究有助于全面地了解昆蟲小分子熱激蛋白的功能。

春尺蠖屬鱗翅目、尺蛾科，是一種雜食性害蟲，在我國多個省、自治區(qū)被列為重點監(jiān)測對象[11-12]。近年來，春尺蠖危害呈擴大趨勢，危害對象由楊、柳、桑、檸條和梨等林木，逐漸擴大至開始危害玉米、小麥等農(nóng)作物，危害區(qū)域從內(nèi)蒙古、新疆等北方地區(qū)逐漸向四川、云南等南部地區(qū)遷移。為深入了解熱激蛋白與春尺蠖生長發(fā)育的關(guān)系和在饑餓脅迫中的作用機理，本研究在已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得1條小分子熱激蛋白基因，分析其蛋白理化性質(zhì)以及在不同時間饑餓處理下的表達(dá)譜。

1 材料與方法

1.1 供試材料

春季去烏拉特前旗檸條人工草場采集春尺蠖雌雄成蟲帶回實驗室，以檸條錦雞兒成對飼喂，待其產(chǎn)卵后，將卵置于人工氣候箱中在恒溫22℃±1℃，光周期L∶D=18∶6和相對濕度（RH）55%～59%條件下培養(yǎng)，幼蟲孵化后，用實驗室內(nèi)種植的檸條錦雞兒連續(xù)飼養(yǎng)，選取4齡幼蟲（均為蛻皮后2 d）以備試驗。

1.2 研究方法

1.2.1 饑餓脅迫處理方法

對春尺蠖4齡幼蟲在不同饑餓處理（6 h、24 h和72 h，以正常飼喂檸條錦雞兒的春尺蠖4齡幼蟲為對照）條件下測定轉(zhuǎn)錄組，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)10只供試?yán)ハx。

1.2.2春尺蠖AcinHsp19.4基因的獲取方法

根據(jù)本實驗室前期測定的春尺蠖幼蟲不同時間饑餓脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及差異基因表達(dá)趨勢圖及功能注釋信息，同時結(jié)合BlastP驗證，從中篩選出具有完整CDS序列的sHSP基因，命名為AcinHsp19.4（GenBank登錄號∶MW336984）。

1.2.3 春尺蠖AcinHsp19.4基因的生物信息學(xué)分析

利 用 NCBI ORF Finder （https∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）來預(yù)測春尺蠖AcinHsp19.4基因蛋白編碼序區(qū)。使用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（http∶//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測春尺蠖AcinHsp19.4基因編對AcinHsp19.4氨基酸的同源序列的一致性。應(yīng)用在線預(yù)測 工 具 SignalIP5.0 （http∶//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測AcinHsp19.4基因N端信號肽。采用TMHMM 軟 件 （http∶//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測。利用MEGA6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ），同時采用P距離（P-distance）重復(fù)運行1 000次重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 春尺蠖Acin Hsp19.4基因在饑餓脅迫下的表達(dá)分析

從圖1中可以看出，AcinHsp19.4基因的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，在處理0 h（對照CK）、6 h和24 h后，表達(dá)量差異不顯著，直到處理72 h后，表達(dá)量迅速上升且差異顯著（P＜0.05）。

2.2 AcinHsp19.4基因蛋白的理化性質(zhì)分析

春尺蠖Acin Hsp19.4基因蛋白預(yù)測分子式為C872H1359N233O261S3，序列全長516 bp，共編碼171個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為19.38 kD，等電點為5.56；半衰期和脂肪指數(shù)分別為30 h和78.01，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總電荷的27高于正電荷殘基（Arg+Lys）總電荷的22；該蛋白的親水性為-0.560，為疏水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為40.33，大于參考值40，故其為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白具有小分子熱激蛋白典型的α-晶體結(jié)構(gòu)域。AcinHsp19.4在N端不含信號肽且無跨膜區(qū)。

2.3 春尺蠖基因的同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

將春尺蠖AcinHsp19.4基因的氨基酸序列（圖2）與NCBI中搜索得到的其它昆蟲序列進(jìn)行比對，分析結(jié)果表明，春尺蠖AcinHsp19.4基因氨基酸序列與同為尺蛾科的樺尺蠖一致性最高，達(dá)到87.72%，其次為家蠶和斜紋夜蛾，分別達(dá)到69.77%和69.71%，而與其它鱗翅目昆蟲一致性較低，均低于60.00%，其一致性分別為吊絲蟲59.43%，二化螟55.56%，粘蟲55.00%，云杉芽卷蛾52.78%。

圖 1 AcinHsp19.4在春尺蠖不同時間饑餓處理下的表達(dá)譜

圖 2 春尺蠖AcinHsp19.4基因的核苷酸及推導(dǎo)的編碼氨基酸序列（A）及序列包含的保守結(jié)構(gòu)域（B）

圖 3 春尺蠖與其它昆蟲sHsp基因的氨基酸序列比對

圖 4 春尺蠖與其它昆蟲sHSP氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過NCBI搜索其他目昆蟲已上傳的sHsp的氨基酸序列與春尺蠖AcinHsp19.4序列信息（圖3）結(jié)合，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示（圖4），進(jìn)化樹中的各鱗翅目昆蟲分別聚在不同分支上；在鱗翅目的分支上春尺蠖的sHSP與同為尺蛾科的樺尺蠖的sHSP聚為一類，表明二者親緣關(guān)系最近，其次為夜蛾科的草地貪夜蛾和斜紋夜蛾，與鞘翅目的谷斑皮蠹，直翅目的中華稻蝗親緣關(guān)系逐次變遠(yuǎn)。

3 討論

本研究在前期已測春尺蠖4齡幼蟲不同時間饑餓處理下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到1條小分子熱激蛋白基因，經(jīng)BlastP比對發(fā)現(xiàn)其包含小熱激蛋白典型的α-晶體結(jié)構(gòu)域，結(jié)合同源序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果，推測該基因為春尺蠖小分子熱激蛋白。小分子熱激蛋白具有的典型結(jié)構(gòu)域不僅在分子識別中起到重要作用，而且在分子伴侶功能方面扮演著重要角色，同時是sHSP的典型特征，在分子進(jìn)化分析的研究中具有重要作用[13，14]。

系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明，鱗翅目、鞘翅目和直翅目昆蟲分別聚在不同分支上，在鱗翅目分支上春尺蠖Hsp19.4與同為尺蛾科的樺尺蠖Hsp19.4聚為一類，與鞘翅目的谷斑皮蠹，直翅目的中華稻蝗親緣關(guān)系逐次變遠(yuǎn)；分子量相近或相同的sHSP則分別聚在一支。在棉鈴蟲中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，說明sHSP不僅具有保守性，同時具有種屬的特異性[15]。

昆蟲在漫長的進(jìn)化過程中，為了抵御外界不利環(huán)境的脅迫，自身進(jìn)化出很多防御措施，其中熱激蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)就是一種手段[16，17]。近年的研究表明，熱激蛋白在昆蟲應(yīng)對饑餓脅迫方面發(fā)揮著重要作用[18，19]。例如，熱激蛋白HSP70在異色瓢蟲在饑餓處理8 h后表達(dá)量達(dá)到峰值[20]。利用RNAi技術(shù)沉默赤擬谷盜Hsp18.3基因后，其耐饑餓能力顯著下降[8]。在本研究中，AcinHsp19.4在饑餓處理72h后，表達(dá)量上調(diào)表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致，說明Acin Hsp19.4在春尺蠖應(yīng)對饑餓脅迫的過程中起到重要作用。

本研究從春尺蠖轉(zhuǎn)錄組中鑒定得到AcinHsp19.4蛋白基因，并分析了分子特征和蛋白的理化性質(zhì)，同時分析了其在不同時間饑餓脅迫處理下的表達(dá)情況，為下一步探究春尺蠖熱激蛋白與生長發(fā)育的關(guān)系，以及在饑餓脅迫下的作用機理奠定基礎(chǔ)。