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        HPLC-ELSD 法測(cè)定不同品系金線蓮中金線蓮苷的含量

        2021-07-08 09:21:50黃曉萱張嘉嘉
        福建中醫(yī)藥 2021年6期

        黃曉萱,張嘉嘉,楊 漪,林 羽,張 勛

        (福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

        金線蓮為蘭科植物花葉開(kāi)唇蘭[Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.]的干燥全草,為閩臺(tái)特色藥材[1]。 金線蓮性平,味甘,歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng),具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕的功效,主治腎炎、膀胱炎、糖尿病、支氣管炎、小兒急驚風(fēng)等病癥[2]。 金線蓮苷為金線蓮主要活性成分,現(xiàn)代藥理研究表明金線蓮苷具有降血糖[3]、降血脂[4]、保肝護(hù)肝[5]和改善骨質(zhì)疏松[6]等作用。 課題組前期調(diào)研發(fā)現(xiàn):福建金線蓮具有多種不同外觀性狀,形成不同品系,包括大圓葉、小圓葉、尖葉等[7]。 金線蓮中金線蓮苷含量的測(cè)定方法已有相關(guān)報(bào)道,但目前為止尚少有對(duì)不同品系金線蓮的金線蓮苷含量的分析評(píng)價(jià)。 本研究擬通過(guò)高效液相色譜聯(lián)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品系金線蓮的金線蓮苷含量測(cè)定,以期為金線蓮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考依據(jù)。

        1 材 料

        1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀、Alltech 3300 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)GRACE 公司);萬(wàn)分之一 AR224CN 電子天平、十萬(wàn)分之一EX225DZH 電子天平(奧豪斯儀器有限公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);MILLI-Q Direct16 超純水機(jī)(美國(guó) Millipore公司)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)材料 金線蓮苷對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)有限公司,批號(hào):18081329);甲醇、乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);色譜乙腈(上海默克化工技術(shù)有限公司);實(shí)驗(yàn)用水采用自制二次蒸餾水。 種植金線蓮18 批,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授鑒定為 Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.的全草,樣品信息見(jiàn)表1。

        表1 樣品信息

        2 方法與結(jié)果

        2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取金線蓮苷對(duì)照品適量,加入甲醇超聲溶解,定容配制成金線蓮苷對(duì)照品溶液(即每1 mL 含2.012 mg 的金線蓮苷),于4 ℃冰箱保存,備用。

        2.2 色譜柱的優(yōu)化 分別考察了Uitimate?HPLC NH2色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX NH2色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)和 Waters XBridge?BEH Amide 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)對(duì)色譜峰的分離效果,結(jié)果Uitimate?HPLC NH2色譜柱基線平穩(wěn),色譜峰峰型尖銳且無(wú)裂峰出現(xiàn),故選擇此色譜柱來(lái)分析樣品。

        2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱:Uitimate?HPLC NH2色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶水(85∶15);流速:1.0 mL/min;霧化室溫度:70 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;載氣為高純度氮?dú)?,氮?dú)饬魉伲?.5 L/min;增益值:8。

        2.4 提取條件的優(yōu)化 精密稱取金線蓮樣品粉末約0.15 g,于50 mL 具塞三角燒瓶中,在超聲功率350 W,頻率50 kHz 條件下,考察不同提取溶劑的提取效果,分別考察了純水、甲醇(20%、40%、60%、80%、100 %)、乙醇(20 %、40 %、60 %、75 %、95 %)的提取率,結(jié)果40 %甲醇的提取效率最高。 此外,對(duì)最佳提取時(shí)間(10、15、20、25、30 、40 min)和提取溶劑用量(20、30、40、50、60 mL)進(jìn)行考察,選擇提取溶劑用量50 mL, 超聲提取15 min 作為提取條件。取18 批金線蓮樣品粉末,按上述最佳提取條件提取,放冷,0.45 μm 濾膜濾過(guò),即得供試品溶液。精密吸取40 %甲醇、 對(duì)照品和供試品溶液各10 μL,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析,理論塔數(shù)按金線蓮苷峰計(jì)>3 000。40 %甲醇、對(duì)照品和供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

        圖1 40 %甲醇、對(duì)照品及供試品溶液色譜圖

        2.5 線性關(guān)系 取“2.1”項(xiàng)下的金線蓮苷對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋至 804.80、562.38、337.43、202.46、121.47、72.88、43.73 μg/mL,按“2.3”項(xiàng)下的色譜方法測(cè)定峰面積。以峰面積積分值(mAU)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y),對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,得金線蓮苷線性回歸方程:Y=1.3370X+7.384 9(r=0.999 8),表明金線蓮苷進(jìn)樣量在0.437~8.048 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.6 方法學(xué)考察

        2.6.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取金線蓮樣品(批號(hào)20180518-2) 1 份,按“2.4”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析,1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次測(cè)定日內(nèi)精密度,連續(xù)3 d 測(cè)定日間精密度。日內(nèi)精密度RSD 為1.2 %,日間精密度RSD為2.7 %,表明儀器精密度良好。

        2.6.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取金線蓮樣品(批號(hào)20180518-2) 1 份,按“2.4”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,置于室溫 0、2、4、6、8、12、24 h 后,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定金線蓮苷的峰面積,計(jì)算金線蓮苷含量。 含量RSD 小于3.0 %,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        2.6.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取金線蓮樣品(批號(hào)20180518-2) 6 份,按“2.4”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下測(cè)定金線蓮苷的峰面積,計(jì)算金線蓮苷含量。 含量RSD 為1.1 %,表明此方法具有良好的重復(fù)性。

        2.6.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的金線蓮樣品(批號(hào) 20180518-2,含量 25.24 %) 0.075 g,按低、中、高濃度(約相當(dāng)于0.075 g 樣品中所含金線蓮苷量的50 %、100 %、150 %)添加金線蓮苷對(duì)照品溶液。 每個(gè)濃度溶液按“2.4”項(xiàng)下制備方法平行制備3 份,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,計(jì)算加樣回收率。 結(jié)果低、中、高濃度添加的加樣回收率(n=3)分別為 93.22 %、94.89 %、97.22 %,RSD 分別為1.8 %、1.6 %、2.0 %,平均加樣回收率為95.11 %,RSD 為2.6 %,表明該方法回收率良好。

        2.7 含量測(cè)定 將樣品按照“2.4”項(xiàng)下制備方法制成供試品溶液,并按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析,得到結(jié)果運(yùn)用“2.5”項(xiàng)中方程計(jì)算,測(cè)得金線蓮苷含量。 見(jiàn)表2。

        表2 樣品金線蓮含量測(cè)定結(jié)果

        3 討 論

        本研究測(cè)定了尖葉、大圓葉、小圓葉3 個(gè)不同品系金線蓮中金線蓮苷含量,3 個(gè)品系均含有金線蓮苷成分。 尖葉品系金線蓮苷含量范圍為22.47%~24.65%,均值為23.41%;大圓葉品系金蓮苷含量范圍為22.73%~27.02%,均值為25.17%;小圓葉品系中金線蓮苷含量范圍為19.39%~23.09%, 均值為21.14%。 同一品系各批次金線蓮苷含量相差較大,可能與種苗來(lái)源、產(chǎn)地等因素有關(guān)。 不同品系種植金線蓮間的金線蓮苷含量相差不大。

        本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD 法,實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品系金線蓮中金線蓮苷含量的測(cè)定,該方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確,可為金線蓮的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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